徠卡顯微鏡：熒光定量
眼見為實-測量知道。這個方程反映在14 個世紀科學的發(fā)展，從自然哲學到現(xiàn)代科學同樣適用于熒光成像和生物科學技術(shù)。顯微鏡生成圖像不僅用于說明，但也量化。更先進的技術(shù)使用照明模式（無圖像形成）或不會產(chǎn)生形象可言-但仍然是顯微技術(shù)。這些F-技術(shù)正變得越來越重要，在當前生物科學。
的擾動和松弛：FRAP和FPA
一個非常著名的化學和物理的方法是放松方法。測量的信號-在我們的例子中的熒光強度-平衡常數(shù)。-作為一個脈沖或跳的參數(shù)發(fā)生擾動后，強度將改變，并達到新的平衡。動力學的變化反映了該機制的細 節(jié)，排除競爭的途徑。該計劃提供了一個優(yōu)雅的方式來測量熒光標記分子的流動性。如果該字段的一小部分是通過施加強烈的光線（脈沖擾動）漂白，熒光將減少。情況下，分子是不能移動的，漂白面積將保持黑色。如果熒光分子通過擴散或通過活動進程，可以移動，將再次恢復熒光漂白區(qū)域。因此，這個協(xié)議被稱為熒光漂白后恢復（FRAP）。擬合模型曲線的松弛部分的信號所揭示的基本機制。和分數(shù)的分子是不動的（不動的分數(shù)）是來自于均衡信號電平的比值。
圖 1：時間在FRAP實驗過程中的熒光強度。在一個感興趣的區(qū)域中，漂白后的熒光的強度恢復到一個新的平衡?；謴蛧嵉?/2的一半時間，容易地提取從回收的動力學。另外，不動的部分漂白脈沖之前和之后的均衡強度的差異是明顯的。
FRAP通常用于測量在細胞中的擴散過程。除了傳統(tǒng)的FRAP，有時會使用衍生工具：瓣，這是熒光漂白后虧損。在這里，漂白連續(xù)發(fā)生在一個地區(qū)，有沒有交集漂白面積。iFRAP表示整場除了一個小區(qū)域被漂白的方法。發(fā)現(xiàn)更多的縮略詞漂白方法，但這些都沒有實際意義。
技術(shù)上相似，但基于一個完全不同的機制，激活熒光蛋白實驗。這些蛋白是熒光的，并可以由不同的照明顏色的接通和關(guān)斷。或者，熒光發(fā)射光譜的變化后，開關(guān)照明。它的優(yōu)點是，人們可以對一個黑色的或不同顏色的背景中檢測到的熒光，并按照在細胞或組織（熒光蛋白激活FPA）的分子的擴散或主動轉(zhuǎn)運。
這些方法并不只適用于流動性的測量，但也動力學測量濃度的變化。最為人熟知的，如鈣離子指標。莫代爾生物傳感器，往往基于FRET-FLIM的，允許各種各樣的細胞以被監(jiān)視的參數(shù)，其中包括代謝物的濃度和膜電位。
福斯特的相互作用：FRET
圖 2：如果發(fā)生福斯特共振能量轉(zhuǎn)移的供體與受體的激發(fā)光譜，兩個分子重疊的發(fā)光光譜非常接近（幾埃）。時的距離一半的光子將被轉(zhuǎn)移由該過程被稱為福斯特半徑（通常為0.2?1納米）。
當從熒光分子發(fā)射一個光子，波長為斯托克斯位移紅色，即能量小于激發(fā)。如果第二個熒光分子（接受器）的第一個分子的排放物（捐贈者D）的范圍內(nèi)的激發(fā)能的緊密接觸，能量被轉(zhuǎn)移的概率增加的距離的6 個功率不發(fā)射和吸收（無輻射）。這種現(xiàn)象進行了分析，并首先正確描述西奧多·福斯特，因此被稱為福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。
一個直接的應用FRET的受體后，僅捐助照明（敏排放SE）所發(fā)出的熒光分析。另外，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率由漂白的受體和供體熒光測量前，漂白后也被測量。如果發(fā)生FRET，捐助將更加明亮閃耀受體漂白后，沒有能量流動的受體，因此所有的能量轉(zhuǎn)化為供體發(fā)射（受體漂白AB）。進行這樣的實驗證明蛋白質(zhì)相互作用，它們的相對距離。
FRET現(xiàn)象還利用現(xiàn)代生物傳感器。這些是（往往是復雜的）分子，含有的供體和受體。結(jié)合后，或感測目標，該分子將經(jīng)歷構(gòu)象變化，改變D與A部分的相對位置，并因此改變了熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率。這些傳感器是非常敏感的，由于1 / r的6依賴福斯特的Wechselwirkung的。
熒光壽命（FLIM） - 告訴許多故事
圖 3：影響的FRET熒光壽命。如果福斯特半徑內(nèi)的供體，受體是不是沒有能量轉(zhuǎn)移，興奮狀態(tài)持續(xù)時間較長（無需額外漏）。當受體接近供體，能量轉(zhuǎn)移到受體從激發(fā)態(tài)和激發(fā)態(tài)捐助只持續(xù)很短的時間。
分子或原子的電子系統(tǒng)，由一個適當?shù)哪茉矗伾┑墓庾蛹ぐl(fā)時，將假定激發(fā)態(tài)。從這個狀態(tài)下，系統(tǒng)會放松下來到基態(tài)，散發(fā)出熒光光子。顯然，系統(tǒng)必須縈繞在一段時間內(nèi)處于興奮狀態(tài)。這段時間稱為熒光壽命。在一個孤立的分子，平均壽命由量子物理學統(tǒng)治，因此物業(yè)的分子。統(tǒng)計分布的實際生存的平均壽命。典型的平均壽命跨度的范圍為0.5?10毫微秒。
在現(xiàn)實中，熒光分子與其他分子的微環(huán)境中與輻射相互作用。這些參數(shù)可以引起興奮狀態(tài)，放松更quickl。一個眾所周知的現(xiàn)象是動態(tài)與其它分子相互作用的熒光淬滅。這里，作為熱能量損失。第二個途徑是的福斯特Wechselwirkung，如上所述。如果熒光分子（供體）與受體相互作用，平均熒光壽命降低，由于這一事實，即熒光共振能量轉(zhuǎn)移過程是一個額外的競爭通路的熒光發(fā)射通路。熒光壽命的變化，因此表明FRET發(fā)生- FLIM的，這是實際測量的參數(shù)與生物傳感器。最后，激動的狀態(tài)可能與光子相互作用，從而導致進一步轉(zhuǎn)換為其他狀態(tài)，或通過發(fā)射一個額外的光子（刺激啟動返回到基態(tài)發(fā)射）。
排放下降脈沖激發(fā)和隨后的測量是通過測量實際的平均壽命的熒光染料，或通過的調(diào)制激發(fā)和測量的相位和振幅調(diào)制的發(fā)射。最準確的和通用的測量時間相關(guān)的單光子計數(shù)（TCSPC）采用從激發(fā)的第一光子發(fā)射的時間延遲的測量。其結(jié)果是一個分布曲線（通常是一個指數(shù)衰減），它允許提取的壽命曲線擬合。此方法被施加到所有像素的圖像，最后產(chǎn)生的熒光壽命圖像（也被稱為“頭圖”）。在這些圖像中的值是不是灰色的強度，但時代。
除了感測環(huán)境的優(yōu)勢，F(xiàn)LIM的獨立的染料濃度和吸收的工件，例如在深層的樣品。
無圖像的顯微鏡：FCS和衍生工具
圖 4：在HeLa細胞中的TiF1a-GFP映射的濃度。APD的圖像進行的校正與FCS點測量。投資回報為FCS測量顯示為黑色十字架。的濃度，計算從自相關(guān)曲線（紅色和藍色的曲線圖）。細胞內(nèi)的濃度是一個空間的地圖。相關(guān)曲線測量點產(chǎn)生顆粒蠕動信息。
共聚焦顯微鏡觀察是從一個微小的衍射光斑發(fā)出的光。該測量是作為時間的函數(shù)的光的強度。通過掃描在樣本點和斬波信號轉(zhuǎn)換成短條，這些位可以被分配并存儲在一幀存儲區(qū)中的像素。如果正確觸發(fā)，幀存儲包含作為一個兩維空間的功能（圖像）的強度分布。
另一方面，它也有可能只分析信號及其變化-帶或不當場移動樣品。這種方法允許多種測量。首先，平均強度通常會減少由于漂白現(xiàn)象。此外，三重態(tài)動力學測量的不同層次之間的照明開關(guān)。最常見的，而不是平均的信號，但該信號的變化（波動）進行了分析。如果是所觀察到的樣品中的許多分子，有關(guān)的信號的波動是非常小的，因此無法估量的。這種微小的共聚焦的焦點只包含幾個分子（取決于上的光學參數(shù)和染料濃度，當然）具有有益的功能。小分子的數(shù)量足以探測到由于擴散（或任何其他傳輸機制），焦點體積變化的發(fā)生是由于分子閃爍（分子承擔暗的狀態(tài)，并返回到興奮狀態(tài)）的數(shù)量和改建。
通過相關(guān)方法的變化的分析，允許測量的染料濃度（樣品中的局部變化）和傳輸動力學。通過擬合模型系統(tǒng)來測量的相關(guān)功能，相關(guān)的分子運輸機制的分類是可能的。定性的測量也是可能的 - 例如，在各個隔室的擴散系數(shù)。
已經(jīng)開發(fā)了各種衍生方法的分離特定的相關(guān)性（FCCS）或改進的結(jié)果的可靠性和精確度（FLCS）。
電和光遺傳學
除了上面提到的F-技術(shù)，很多其他的定量方法在現(xiàn)代研究。最突出的是，大腦的研究是一個領(lǐng)域的各種測量，使用顯微鏡和熒光。一個經(jīng)典的測量電信號的熒光強度的變化（例如誘導的Ca 2 +濃度的變化檢測出鈣指示器）的相關(guān)性。的電信號通常，在大多數(shù)情況下通過膜片鉗技術(shù)測量電極。
最先進的光遺傳學的方法，即轉(zhuǎn)基因修改應用光功能的蛋白質(zhì)，是進入一個新的世界，需要測量的相關(guān)性。
圖 5：強度圖（上圖），電氣數(shù)據(jù)（底部）在心肌細胞膜片鉗實驗記錄。電流記錄（紫色），觸發(fā)脈沖（紅色）和行觸發(fā)（綠色）。熒光數(shù)據(jù)線數(shù)據(jù)采集的觸發(fā)表明是完全同步的。禮貌：雷夫霍夫馬德森，西班牙巴塞羅那，加泰羅尼亞心血管病研究所。