奧林巴斯顯微鏡：相差顯微鏡的原理

搜索仍然是在1930年找到一種方法使用未染色的對象不吸收光產(chǎn)生良好對比度的圖像直接和衍射光從各個方位。在此期間，由Frits Zernike研究露天零階和偏離的光，可以進行修改，以產(chǎn)生干擾的有利條件和對比度增強的相位和振幅之間的差異。

未染色的標(biāo)本不吸收光的相位被稱為對象，因為它們稍微改變試樣的衍射的光的相位，通常是通過延緩這樣的光相比，約1/4波長的不偏離的直接光通過試樣周圍不受影響。不幸的是，我們的眼睛和相機膜，無法檢測到這些階段的差異。在此重申，人眼敏感的可見光譜的顏色（光頻率的變化）或不同程度的光強度（波的振幅的變化）。

在第一階段的標(biāo)本，直接零階光穿過或前后試樣不偏離。但是，試樣的光衍射的幅度在減小，因為它是在對象的光吸收，但速度降低的試樣，由于試樣的折射率或厚度（或兩者）。大約1/4波長的滯后，這種衍射光，到達上面的不偏離的光的步驟（也稱為相位）與圖像平面，但在干擾強度基本上不受減損。其結(jié)果是，上面目鏡水平的圖像，所以缺乏對比度，使細節(jié)幾乎看不見。

制定未染色的方法-現(xiàn)在被稱為相差顯微鏡- 澤尼克成功，相對象產(chǎn)生對比度的圖像，好像他們是振幅對象。振幅對象顯示優(yōu)異的對比度時，衍射和直射光步驟（顯示的相位差）的波長的1/2。Zernike的方法是加快由1/4波長，使直接光的相位標(biāo)本的直接和偏離光之間的波長差，現(xiàn)在是1/2波長。其結(jié)果是，直接和衍射光到達目鏡圖像的水平將是能夠產(chǎn)生相消干涉（見吸收先前所描述的對象上形成圖像的部分）。出現(xiàn)對較亮的背景暗的圖像的詳細信息中的這樣的程序的結(jié)果。這就是所謂的黑暗或正相差?；?/span>相差顯微鏡配置的示意圖，在圖1中示出。

另一種可能的使用的情況少得多的，當(dāng)然，是安排減緩由1/4波長，使直接光的衍射光和直射光到達目鏡在步驟建設(shè)性干涉。這種安排的結(jié)果在一個明亮的圖像較暗的背景上的標(biāo)本的細節(jié)，被稱為消極或鮮明的對比。

相差顯微鏡是非常成功的，并最終獲得了廣泛的應(yīng)用，從而在澤尼克獎的prestigeous諾貝爾物理學(xué)獎于1953年。相差技術(shù)譽為顯微鏡在一個世紀(jì)的最偉大的進步。相差，通過“轉(zhuǎn)換”相如生活材料為振幅標(biāo)本標(biāo)本，使科學(xué)家能夠看到細節(jié)未染色和/或生活對象與以前從未實現(xiàn)的清晰度和分辨率。

該的澤尼克方法涉及直接的零階光的衍射光在物鏡的后焦平面的分離。要做到這一點，一個環(huán)形環(huán)形帶被放置在正下方的下透鏡的聚光鏡，在聚光鏡的前焦平面，共軛的物鏡的后側(cè)焦點面。由于空心錐形從環(huán)形的光穿過試樣不偏離時，它到達上面的后側(cè)焦點面中的物鏡的形狀的光的環(huán)。微弱的光衍射標(biāo)本遍及整個后焦平面的客觀。

如果不允許的，因為這樣的組合，進行目鏡的像面的衍射光將是約1/4波長的直射光的背后。上面的圖像平面的衍射光的相位將是與直接光的相位，但其干擾的振幅幾乎相同的直射光。這將導(dǎo)致非常小的標(biāo)本的對比。

要加快直接不偏離零階光，安裝與連接到它上面的后側(cè)焦點面上的客觀的環(huán)形移相器的相位板。窄區(qū)域的相位差板的光學(xué)厚度比其余板塊。其結(jié)果是，不偏離的通過相環(huán)的光行進在遍歷的物鏡比的衍射光的玻璃的更短的距離。

現(xiàn)在，當(dāng)直接的不偏離的光的衍射光進入到像平面，它們是1/2波長彼此同相。的衍射和直接光現(xiàn)在可以相消干涉，使試樣的細節(jié)出現(xiàn)暗對較亮的背景（就像他們做為吸收或幅度標(biāo)本）。這是一個描述發(fā)生的事情的在正面或暗相差。

如果環(huán)形移相器的相位板的面積比其余板塊厚，直接光的速度降低1/4波長。在這種情況下，零級光到達在步驟（或同相）的衍射光的像面，并發(fā)生相長干涉。較暗的背景上的圖像會出現(xiàn)明亮。圖像較暗的背景上出現(xiàn)亮點。這種類型的相差被描述為負或鮮明的對比。

因為不偏離的光的零級比微弱的衍射光要亮得多，一個薄吸收透明金屬層沉積環(huán)上，帶來的直接和衍射光的強度成更好的平衡，以增加對比度。另外，因為加快或放慢的直接光計算的綠色光波長的1/4，相圖像會出現(xiàn)一個綠色的過濾器時最好放置在光路（綠色干擾濾波器最好）。這樣一個綠色過濾器還可以幫助消色差物鏡產(chǎn)生最佳圖像，因為消色差透鏡球糾正綠燈的。

附件需要相差工作的一個臺下相差聚光鏡配備年輪相差物鏡和一組，每一個都有安裝的相位板。該聚光鏡通常具有與孔徑光闌和年輪的旋轉(zhuǎn)刀架的（不同放大倍率的各相物鏡，需要增加直徑的環(huán)形空間的物鏡的放大率增加）的明視場位置。每個階段的物鏡，有一個黑暗的環(huán)在其背部的鏡頭。這些物鏡也可用于普通明場透射光的工作，只有輕微的降低的圖像質(zhì)量。

相位裝的，由生產(chǎn)商提供的，通常包括綠色濾色器和一個相位望遠鏡。后者是用來，使顯微鏡下車聚光鏡環(huán)環(huán)相板疊加到。臺下聚光定心螺釘?shù)囊唤M允許操縱該環(huán)形帶的對齊，同時觀察后焦平面相位望遠鏡（或通過伯特蘭透鏡）中的物鏡。

設(shè)立一個相顯微鏡（臉頰襯里細胞是一種現(xiàn)成可用的測試材料），10X階段物鏡聚焦樣本。接下來，配置的科勒照明顯微鏡的使用明場（0）位置的聚光鏡。這是關(guān)鍵的步驟，以保證適當(dāng)對準(zhǔn)顯微鏡的物鏡，聚光鏡和視場光闌。正確對準(zhǔn)后顯微鏡，開拓聚光鏡光圈和搖擺炮塔聚光鏡到10的位置（這通常會自動打開光圈）。將綠色過濾器在光路中，然后取出一個目鏡。插入相位望遠鏡，同時觀察的物鏡的背面，使用為中心的環(huán)隙中心的環(huán)形帶的環(huán)板的螺絲。伯特蘭透鏡或針孔目鏡，如果有的話，將允許后焦平面的客觀的視圖。相環(huán)居中往往更容易做，如果試樣從光路被暫時移除。對齊后相環(huán)與環(huán)，重新插入目鏡和地點到適當(dāng)?shù)牡胤皆诠饴凤@微鏡舞臺上的標(biāo)本。

重復(fù)相同的步驟，為每個物鏡，確保炮塔旋轉(zhuǎn)，所以適當(dāng)?shù)南辔画h(huán)的定位是相匹配的物鏡放大倍率。一些制造商提供單個推入，定心，年輪，可以被插入到共同的阿貝聚光的下部。這種價格低廉，簡單的設(shè)備做好與10X，20X和40X的階段物鏡，但只能接收一個聚光鏡一次。

顯微結(jié)構(gòu)的影響仍然是一種廣泛使用的重要工具，特別是對的顯微鏡研究生活和/或未染色的材料，如在培養(yǎng)的細胞和組織。的方法，目前也正在同時使用反射光的熒光不發(fā)出熒光的標(biāo)本揭示了區(qū)域。相顯微鏡技術(shù)是特別有用的與薄，分散在視場中的標(biāo)本。

相差顯微鏡有一些限制：

· 相圖像通常光暈所包圍的輪廓細節(jié)。這樣的暈光的文物，有時模糊的邊界細節(jié)。

· 相環(huán)空限制工作的光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑在一定程度上，從而降低分辨率。

· 相差不厚的標(biāo)本，因為在第二階段的轉(zhuǎn)變發(fā)生略低于或略高于平面處于焦點地區(qū)。這種相移的形象混淆和歪曲的圖像細節(jié)。

· 如果使用白光和綠色，如果綠色過濾器是用來相圖像顯示為灰色。在過去，許多顯微鏡為黑色和白色相標(biāo)本進行顯微攝影時限制他們的電影。今天，許多彩色膠片再現(xiàn)黑色，白色，和灰度非常有效，尤其是鎢均衡的透明膠片，富士，柯達，愛克發(fā)。

顯微結(jié)構(gòu)的影響是另一個例示的光在臺下聚光透鏡級較低的操作和上面的客觀的后側(cè)焦點面上的水平如何通過目鏡觀察到的圖像時，具有顯著的效果