尼康顯微鏡：電動顯微鏡的結(jié)構(gòu)

電動顯微鏡部件及配件啟用研究者活細胞圖像采集自動化，范圍從毫秒到幾十或數(shù)百分鐘的時間刻度間隔時間推移實驗是特別有用的?？梢约友b各種各樣的售后輔助部件，如機電遮光器，電動物鏡轉(zhuǎn)盤，微處理器控制的濾波器切換（濾光輪），電動載物臺，和軸向聚焦控制機制的研究級顯微鏡和交互控制由一個同伴工作站計算機使用市售圖像采集軟件包。然而，應(yīng)該注意的是，組裝一個完全自動化的和優(yōu)化的多維光學(xué)成像系統(tǒng)是一個非常復(fù)雜的任務(wù)。

各種商業(yè)系統(tǒng)可在非常高的成本，而這些往往是值得投資的多用戶的核心設(shè)施。另外，成本可以降低至少50％的從頭組裝系統(tǒng)，但這一努力應(yīng)僅限于實驗室，具備足夠的專業(yè)知識和經(jīng)驗，在光學(xué)顯微鏡。自動顯微鏡配置的首要問題是從不同渠道購買到良好的協(xié)調(diào)，高效的系統(tǒng)集成的硬件和軟件組件。較新的系統(tǒng)從各大顯微鏡制造商正變得越來越更配備了更先進的高速快門，軸向聚焦控制系統(tǒng)，過濾器的更換器，照明源和強度控制，以及其它電動部件完全集成的高檔與專有軟件執(zhí)行。

圖1中的廣義活細胞成像配置利用一個倒置的組織培養(yǎng)顯微鏡。圖中示出的所有的輔助構(gòu)件維持培養(yǎng)所必需的，同時取得下的圖像的明視場，相襯，微分干涉對比，和熒光照明。試樣腔室在載物臺上的位置，通常牢固地附著在圓形或矩形的載物臺的物鏡開口，除簡單的顯微鏡載玻片。培養(yǎng)室環(huán)境是一個有機玻璃外殼的，內(nèi)置顯微鏡聚光系統(tǒng)，載物臺，物鏡，和物鏡轉(zhuǎn)換器。由同一個控制單元，可監(jiān)控機箱溫度，而其他單位調(diào)節(jié)加熱載物臺和物鏡加熱器的二氧化碳傳感器和饋線罐閥。操作與一個單獨的控制單元，其連接到主計算機（圖中未示出）的激發(fā)和發(fā)射濾光片輪和CCD攝像系統(tǒng)。所有的設(shè)備被安裝在一個面包板式隔振平臺。

光閘

機電遮光器擋住光源照亮標本相機曝光（次），是特別重要的，當成像細膩熒光標本作為一種手段，最大限度地減少漂白和光毒性。這些設(shè)備是絕對必要的活細胞成像在很長一段時間，以確保并維持細胞活力。此外，遮光器可被用于選擇多個光源和通路之間，例如，當傳輸和熒光模式之間迅速轉(zhuǎn)乘收集兩時間推移序列在每個時間點的圖像?，F(xiàn)代高性能快門的速度和機制快門功能允許用戶管理的幾種模式，由微處理器控制和操作能力。快速模式提供了最快的打開和關(guān)閉快門的動作順序能夠。稍微慢軟模式逐步打開和關(guān)閉快門，以減少振動，并產(chǎn)生更安靜的運行。不影響波長的光強度控制容納由的中性密度快門模式，使有效孔徑尺寸的精確控制，在快門打開狀態(tài)，使它能夠作為一個中性密度濾光片。許多快門控制器提供多種操作模式，可以連接一臺工作站，來協(xié)調(diào)兩個或兩個以上光閥的動作。更強大的快門壽命評分數(shù)以百萬計的周期。

圖2給出了幾個發(fā)現(xiàn)的快門設(shè)計，廣泛使用在活細胞成像顯微鏡配置。的剖視圖（圖2（b））示出了內(nèi)部工作機制是描繪在圖2（a）中所示系統(tǒng)的基本快門。快門葉片揮舞鍘刀時尚到位，以關(guān)閉光圈蘸通過保險杠和形彈簧絲組成的系統(tǒng)執(zhí)行器和搖臂驅(qū)動臂組件。電子快門電樞通過接口連接器連接到外部控制單元可以單獨或通過一臺主機操作。靠近顯微鏡幀，不與其他部件干涉的情況下，使附著在上面的快門的基礎(chǔ)上設(shè)計的截止邊。圖2（c）中示出的濾光輪快門可以作為一個獨立的開閉器或連接的電動化的（如下所述）進行精確的同時控制曝光時間和波長的濾光輪。

遮光器為顯微鏡應(yīng)用程序設(shè)計有光圈的直徑從25毫米到35毫米不等。光圈越小模型操作速度更快，但往往限制了視場，并且能夠產(chǎn)生漸暈的顯微鏡。較大光圈的遮光器是速度較慢，但減少或消除邊緣照明效果。封裝快門的外殼通常是機加工或澆鑄在鋁陽極氧化處理，然后處理，用黑色染料，作為一個散熱片的致動器線圈。無封裝許多遮光器可以增加安裝的靈活性，但這種公開的刀片和其他內(nèi)部組件從灰塵和雜物污染。為了盡量減少加熱用熱的電弧放電燈的活門裝置，顯微鏡應(yīng)用而設(shè)計的光閥應(yīng)具有反射面對照明源的輸入側(cè)上的葉片。鈹銅基板上的鋁 - 的氟化鎂合金沉積典型的高端的反射涂層，而更經(jīng)濟的快門葉片從拋光不銹鋼制造。后者是不作為高反射率的，不散熱，以及合金刀片，但在成本和更耐用的要低得多。

波長選擇

自動多色熒光成像的最重要的組件之一是一種裝置之間進行快速的切換不同波長的光，通過使用多個過濾器，分束單元，直接通過幾個途徑，單色器，或聲光可調(diào)諧濾波器的光（AOTFs）。在標準配置中，安置在一個光學(xué)塊的傳統(tǒng)的熒光過濾器設(shè)置，并包含一個激勵和阻擋（或發(fā)射）的過濾器，以及一個二色鏡，引導(dǎo)到試樣的激勵光的發(fā)射光傳送到檢測器。活細胞成像，采用更先進的過濾技術(shù)，雙色鏡被保留下來，但是往往取代多色的衍生物，它包含多個帶通區(qū)域。激發(fā)和發(fā)射濾光片從光學(xué)塊中移除，并放置在下面描述的外部設(shè)備中的一個或多個。目前，有幾個實際機制自動互換熒光過濾。最常見的涉及旋轉(zhuǎn)的濾光輪是可靠的，價格相對低廉，并支持大量的售后市場和專有圖像采集程序（實際上，驅(qū)動）。濾光輪的主要缺點是它們的開關(guān)速度的限制。售后濾光輪的主要優(yōu)點是其高透光效率和靈活性，以市售的過濾器使用范圍廣。

濾光輪的設(shè)計保持圓形，扁平的光學(xué)干涉濾光片，中性密度濾光片，熱過濾器，過濾器和紫外線過濾器中的輪，可容納4和10之間的直徑范圍從25毫米至50毫米的過濾器（參見圖3和圖4）。輪安裝在鋁外殼，更換過濾器的過濾器插槽方便地訪問，并且是由精確的步進電機的控制由一個外部單元（圖4（a）中示出）。該殼體包含一個光口（到每個過濾器可以連續(xù)旋轉(zhuǎn)），用于連接到顯微鏡的照明源，通過使用專門的適配器，許多輪外殼還容納螺栓上的快門組件。高端濾波器車輪都配有掛耳，使住房要牢固地固定在光學(xué)平臺或振動隔離表。幾個濾光輪設(shè)計有滑動或下拉外部濾波器持有人額外的過濾器（如中性密度），被放置在一系列干擾過濾器安裝到車輪。濾光輪協(xié)調(diào)控制模塊通過內(nèi)部微處理器和功能作為獨立單元或一些濾光輪的協(xié)調(diào)運作，遮光器，數(shù)碼相機，和其它外圍設(shè)備可以被耦合到一個工作站計算機。

一個標準的經(jīng)濟濾光輪可能需要多達100毫秒到一個新的過濾器旋轉(zhuǎn)到位置，而更便宜和更快的車輪可以做的工作，在大約25毫秒。雖然這些速度可能相當迅速出現(xiàn)乍一看，開關(guān)時間尺度需要至少4秒記錄兩個波長的軸向系列20倍光學(xué)部分，因此，從嚴格限制的圖像采集速度快速的細胞過程。此外，過濾器的輪子有可能創(chuàng)建機械振動，可以耦合到檢測器系統(tǒng)通過顯微鏡幀和導(dǎo)致的圖像質(zhì)量劣化。直接連接到顯微鏡的主體時，濾光輪和光閥能夠在操作過程中產(chǎn)生振動，可以持續(xù)數(shù)百毫秒。此神器可以嚴重降低圖像的分辨率。

振動問題也常見于商業(yè)研究級顯微鏡，其可以包含各種各樣的電動元件。在有效地限制這些振動，制造商往往限制了連接的設(shè)備的速度（如軸向驅(qū)動器，物鏡轉(zhuǎn)盤和聚光鏡），或引入運動活動的停止和發(fā)作的圖像采集之間的時間延遲。然而，在許多情況下，這些時間延遲降低了系統(tǒng)的整體性能，往往使不必要的光量的試樣。制造商也在他們的產(chǎn)品庫存增加，包括電動遮光器，濾光輪，熒光立方體炮塔，端口控制器，及相關(guān)配件，所有這一切都是通過一個單一的控制器協(xié)調(diào)。這些外圍設(shè)備，能夠快速從一個觀察模式，自動切換到另一個，是理想的活細胞成像顯微鏡配置。其中提供了新的選擇，是齊焦補償，以配合不斷變化的物鏡，可調(diào)靈敏度微調(diào)對焦機制和電動功能之間的協(xié)調(diào)，以確保定時序列進行無間斷的焦點。

舊顯微鏡，已經(jīng)在該領(lǐng)域大部分是不能夠利用新的自動外設(shè)由廠家提供的，而必須依靠售后設(shè)備。當安裝這些設(shè)備，為謹慎起見，燈箱，濾光輪和快門組合件在一個單獨的支架，外部的顯微鏡，安裝，以消除振動，并允許組件之間的同步，而不需要引入的延遲時間。在大多數(shù)情況下，所附周邊配件的復(fù)雜性需要組件之間的精確對準，并最好由將整個組件安裝在振動隔離表或面包板裝有減震器。這些平臺的預(yù)鉆孔和螺紋安裝孔，以1英寸的間隔下。如圖3中所示，建議設(shè)計，以減少振動工件的濾光輪與快門的配置。圖中所描述的所有組件被牢固地安裝在面包板或隔離表，并設(shè)有一個1毫米之間的空氣間隙的濾光輪和顯微鏡和數(shù)字照相機系統(tǒng)，以減少振動耦合。在圖圖3（a）中，所述照射器的準直器直接安裝到容納在過濾器上的車輪和鋁合金支柱支持的快門?？扉T和變焦適配器之間的差距，防止快速快門的運動從擾亂顯微鏡。同樣地，在圖3（b）中，有濾光輪和顯微鏡的幀，以及和相機之間的濾光輪之間的空氣間隙。

另一個值得關(guān)注的排放口的舊顯微鏡附加濾光輪的潛在影響齊焦，創(chuàng)建帶通波長變化，并促進畸變通過引入到聚焦光束從顯微鏡新興的平面光板。根據(jù)顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的配置后，插入到射出光束的發(fā)射過濾器可能會移位的焦平面上。該工件的嚴重程度來確定過濾器的厚度和折射率。此外，通過一個帶通干涉濾光器以不同的角度聚焦的光通過可以引入的通帶區(qū)域的中心波長的光束的不同部分的變化。這些問題很容易補償售后適配器創(chuàng)建準直顯微鏡排放口（無窮大）的空間，從而使附著的濾光輪及其他光學(xué)元件的平行光路，所提供的適配器。

作為一種替代方法，濾光輪，一些多通道光譜成像系統(tǒng)的設(shè)計，使同時多色成像或光譜分離和線性分解，不改變過濾器的情況下，使用一個單一的數(shù)碼相機的檢測器。這些器件提供了優(yōu)勢，消除運動偽影，往往發(fā)生在連續(xù)成像的濾光輪，保持完美的圖像之間的登記。多通道系統(tǒng)進行定量，多色實驗（如共振能量轉(zhuǎn)移），甚至單像素登記的文物可能導(dǎo)致重大錯誤時，是非常有用的。這些單元的缺點是：在過濾器的能力和減少的有效成像區(qū)域的傳感器，它是減少二分之一或四分之一（根據(jù)內(nèi)部的分束器配置和過濾能力）的限制。較新的多通道系統(tǒng)部分抵消了空間的限制，光分裂成兩個獨立的探測器（數(shù)碼相機），每個配有獨立的過濾途徑和焦點微調(diào)，以確保像素登記。

圖4中示出的波長轉(zhuǎn)換裝置的任一旋轉(zhuǎn)入光路（圖4（a）段）的新的干涉濾光片或成獨立的路徑（圖4（b）和圖4（c））的發(fā)射光通過引導(dǎo)操作。一個典型的濾光輪配置在圖4（a），其中10個單獨的過濾器單元被容納在一個單一的框架?？刂茷V光輪由一個外部單元（未示出），并且可以迅速地在25至40毫秒的時間刻度上的過濾器之間切換。在這些車輪的優(yōu)勢是瞬息萬變的過濾器集和眾多的配置可能性的激發(fā)和發(fā)射光的靈活性。圖4（b）中所示的雙通道成像系統(tǒng)設(shè)有概述圖4（c）中的光學(xué)列車。在隨后的討論中，詳細介紹了這些多通道成像系統(tǒng)，并且正迅速成為一個有用的替代濾光輪。

準直顯微鏡的光出射口，它通過一個單一的二色鏡，入射光束分割成兩個獨立的光譜上不同的光束（見圖4（c）），并通過多通道成像系統(tǒng)的運行方式。一個光束中包含以下的波長的截止點的反射鏡，而另一束包含以上的截止波長。的雙束通過光學(xué)系統(tǒng)被折疊，并可以調(diào)整，相對于頻譜內(nèi)容，強度，和通過適當?shù)倪^濾器來傳遞每個偏振。在過濾過程中，光束通過一個共同的攝像透鏡，形成兩個不同的檢測器的面板上的圖像在空間上和光譜。請注意，每個圖像的位置，以便它被投影的檢測器陣列的一半以上。單一的二色鏡系統(tǒng)，光分割成四個通路，被替換為一個的三重帶通版本，否則的功能基本相同的方式。

設(shè)計中的變化使輸出的多信道系統(tǒng)中，2個攝像系統(tǒng)（如前面所討論的）之間進行分割，使捕獲的全視野的應(yīng)用中，需要使用整個檢測器陣列的兩張圖像。當結(jié)合的狹縫系統(tǒng)和自動翻譯載物臺，多通道系統(tǒng)可適應(yīng)光譜成像調(diào)查。多通道成像系統(tǒng)的主要優(yōu)點之一是消除圖像采集延遲和潛在的振動問題，是由于過濾輪轉(zhuǎn)動事件。因此，任何與捕獲的圖像相關(guān)聯(lián)的延遲落在由檢測器讀出速度的限制。當耦合到電子倍增（EMCCD）相機能夠在非常低的光線水平的快速讀出，多通道成像系統(tǒng)能夠捕捉到的亞細胞發(fā)生的事件，在更快的時間尺度比濾光輪配置。

活細胞共聚焦和多光子顯微鏡成像是有限的可用頻譜線連接到儀器的激光系統(tǒng)。未來的波長選擇在廣角旋轉(zhuǎn)磁盤和掠領(lǐng)域，以及寬帶全內(nèi)反射熒光（白光TIRF）顯微系統(tǒng)最終可能轉(zhuǎn)移，至少在很多高端應(yīng)用，從通干擾濾波器可調(diào)單色，液晶可調(diào)諧濾波器的AOTF （LCTFs）。單色儀光學(xué)顯微鏡相結(jié)合的電弧放電燈的衍射光柵的波長選擇板和照明裝置的聚光系統(tǒng)輸出的光顯微鏡（通常是氙氣）與（見圖圖8（d））。快檢流計驅(qū)動的輸入狹縫和衍射光柵位置的控制時，這些設(shè)備，能夠提供毫秒級精確的波長和帶寬發(fā)生變化。液晶可調(diào)諧濾波器可應(yīng)用于光譜成像，擁有高分辨率，大孔徑，缺乏圖像配準誤差，以及合理的速度進行調(diào)查。在下行路上，LCTFs有限的光譜范圍內(nèi)，不同的帶寬，低透光值（一般為30％的過濾器），以及需要增加光程。聲光可調(diào)諧濾波器是一種新興的波長選擇在激光共聚焦顯微鏡的主力，但目前還沒有看到其他成像模式的廣泛應(yīng)用。之前，必須克服這些設(shè)備使用廣角熒光顯微鏡的活細胞成像應(yīng)用成為常見的問題，如分散，帶寬窄，分辨率低，圖像拖影，和其他文物。

對焦和載物臺控制

聚焦電機所連接的細焦點的傳動齒輪組的顯微鏡，使自動化軸向聚焦控制通過圖像采集軟件。這些器件可以采用具有自動對焦功能的結(jié)合在軟件或收集隨后的解卷積分析和/或三維圖像重建的光學(xué)部分的一疊。電動載物臺可以利用與圖像采集軟件自動翻譯階段之間的兩個或更多的視場或在多井培養(yǎng)皿中以及從一個到另一個。為了收集軸向的圖像棧（簡稱作為?系列），顯微鏡物鏡微調(diào)對焦機制必須加強通過試樣的圖像采集軟件的控制下，在精確的時間間隔。各種電動聚焦裝置，步進驅(qū)動器無論是整個消防水***或顯微鏡載物臺是從顯微鏡制造商和售后市場分銷商。另外，壓電元件可以連接到物鏡轉(zhuǎn)換器，把一個單一的物鏡顯微鏡的光學(xué)軸沿向上和向下。步進電機的主要優(yōu)勢是其較低的成本和幾乎無限的旅行距離，它提供了更多的控制權(quán)收集圖像堆棧。另外，由于步進電機的設(shè)計工作通過顯微鏡傳動齒輪，使物鏡轉(zhuǎn)換器中使用的所有物鏡。步進電機的主要缺點是，它們是低于壓電器件，并表現(xiàn)出顯著更多的滯后。捕獲?序列最快的模式是使用壓電器件，它具有更大的精度和速度比步進電機。然而，壓電驅(qū)動器具有有限的行駛距離（在100和200微米之間）和更昂貴。

圖5是一個高性能的電動拼裝載物臺，含有活細胞成像室。為消除橫向載物臺漂移的可能性和收集時間推移序列采集過程中的連續(xù)的圖像中的兩個或更多個視場這些載物臺是非常有用的。售后市場電動載物臺的設(shè)計無論是直流（DC）步進電機或伺服電機，其特征在于產(chǎn)生更高的翻譯的速度（通常是雙步進機），后者。能夠精確地控制載物臺上的位置（重復(fù)性）取決于編碼器反饋系統(tǒng)，這也決定了決議的載物臺運動。步進伺服電機的主要優(yōu)勢是其耐用性和出色的低速控制。一個典型的電動載物臺的行程范圍內(nèi)，同時在x 和y方向上為2至4英寸，和許多有編碼器，可為40?100納米的分辨率和300至750納米的可重復(fù)性（返回到相同的字段的能力）。大多數(shù)售后電動載物臺能夠安裝多孔板，瓶，培養(yǎng)皿，以及標準的顯微鏡玻片標本持有人，如全方位的。此外，許多載物臺可以適應(yīng)的環(huán)境控制活細胞成像實驗載物臺適配器。電動載物臺，需要一個單獨的控制器系統(tǒng)，通常配有一個操縱桿裝置操縱橫向運動?？刂破骷瓤梢宰鳛橐粋€獨立的設(shè)備或與其他配件的集成到一臺主機通過RS-232串行端口或通用串行總線接口。

顯微鏡焦平面從活細胞中的連續(xù)的圖像的收集過程中的軸向位置的波動的時間推移顯微鏡中最嚴重，最經(jīng)常遇到的問題之一。通常被稱為焦點的漂移，在顯微鏡焦平面的變化通常發(fā)生由于在成像室或房間內(nèi)的溫度變化中，該文書被容納。各種市售的軟件和硬件解決方案已經(jīng)******顯微鏡和廠家售后抗衡焦點漂移。的硬件設(shè)備是測量的物鏡的前透鏡之間的距離和反射的下表面接近的表面上的物鏡（蓋玻片）的試樣通過檢測光或聲音的自動對焦系統(tǒng)。然而，這種方法可以被阻礙，用于高分辨率的油浸物鏡時，由于對比度和反射率作為傳感的光穿過油的損失。最先進的自動對焦系統(tǒng)使用低強度的近紅外線激光或發(fā)光二極管（LED）源，以反映的照明光束，通過物鏡和蓋玻片的上表面上（支持細胞和培養(yǎng)基中沐?。?，隨后回收的物鏡的反射光，并把它傳遞到檢測器上，用于控制的反饋電路來調(diào)整位置的物鏡有關(guān)的蓋玻片培養(yǎng)介質(zhì)接口。

的專有和售后顯微鏡自動對焦系統(tǒng)可以補償所產(chǎn)生的溫度波動的聚焦漂移（如上所述），重力，在浸沒介質(zhì)的粘度變化和振動。最先進的系統(tǒng)操作，通過不斷比較在目前的軸向位置，在安裝過程中收集的參考圖像獲取的圖像。參考通常是從蓋玻片，其強度很容易用一個專門的傳感器電路的測量得到的反射圖案。然后在顯微鏡軸向控制，以補償熱應(yīng)力和機械漂移蓋玻片重新定位在原來的焦平面中，從而提供清晰的對焦。操作員可以定義一個特定值（稱為偏移量）為所需的軸向的焦點，這通常用含水的組織培養(yǎng)基或緩沖液的蓋玻片界面的確切位置偏離。自動對焦系統(tǒng)可以糾正焦點漂移以毫秒為單位的時間表，基于軟件的算法有明顯的優(yōu)勢，這往往需要幾秒鐘（并能產(chǎn)生顯著的光毒性和光）。

變量之間的自動對焦系統(tǒng)進行評估時，應(yīng)該調(diào)查的是他們有能力處理復(fù)雜的成像多種功能在一個單一的標本在的幾個軸向和橫向位置。另一個重要特征是聚焦校正的頻率和精度的補償是否是連續(xù)的，或每個圖像捕獲之前立即應(yīng)用。每種方法都有優(yōu)點。利用實時觀測實驗，連續(xù)反饋系統(tǒng)的效率比那些正確的，獨立的軟件提示。然而，在拍攝圖像時的首要考慮因素，使自動對焦緊接收購前是首選，因為嚴格要求同步圖像采集與測量的參考點（每次重點進行評估，以確定是否發(fā)生漂移）。其中一個重要的時間間隔之間發(fā)生圖像捕獲時間推移實驗，時間相對較短，需要測量焦點位置是無關(guān)緊要的。另一方面，在高速（2?30的每秒幀數(shù)）的在收集圖像流時，自動對焦系統(tǒng)可能會產(chǎn)生一個工件被稱為抖動，當他們試圖糾正焦點無意中圖像拍攝過程中的載物臺翻譯。

在圖6所示的自動對焦系統(tǒng)的主要優(yōu)點是，在漫長的時間的推移實驗中采集的圖像序列。序列中的每幀的表示時間間隔為4小時。樣品是灰狐肺成纖維細胞（線FoLu）細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人β-肌動蛋白的與米櫻桃熒光蛋白融合到細胞培養(yǎng)。集中在熒光標記的肌動蛋白細胞骨架應(yīng)力纖維。請注意，圖6中的單元格（a）至6（四）緩慢漂移的焦點，由于熱波動超過16小時的時間推移序列。明亮和清晰界定的應(yīng)力纖維（圖6（A））定義為重點開始漂移（圖6（b）條），直到唯一標記的肌動蛋白的褶邊和胞漿池，可以可視化（圖6（c）和圖6（d））。相比之下，自動對焦，尖銳的肌動蛋白纖維（圖6（E））分散在視場中央細胞進入中期（圖6（f）條），但重新成為子細胞重新連接到蓋玻片和蔓延（圖6（g）和6（H））。維護期間重點延長時間的推移圖像序列的聚集往往是成功或失敗的實驗基礎(chǔ)。

評估自動對焦系統(tǒng)的最后考慮因素之一是所需要的時間的總長度，用于圖像采集，其范圍可以從數(shù)秒到數(shù)小時到數(shù)天。在較長的實驗，不斷反饋系統(tǒng)可能會阻礙了機械漂移由于滯后或蠕變產(chǎn)生的壓電致動器中的文物。在短期內(nèi)，這些問題通常無關(guān)緊要，但可以顯著關(guān)注長期收購。這些問題都可以復(fù)合使用高數(shù)值孔徑（倍率）窄震源深度要求嚴格控制的物鏡。無論自動對焦系統(tǒng)的潛在文物介紹，他們目前的表現(xiàn)和持續(xù)發(fā)展的潛力已經(jīng)被證明是最重要的資產(chǎn)之一高分辨率熒光顯微鏡的活細胞。

活細胞成像的照明光源

傳統(tǒng)的照明系統(tǒng)采用了廣角鏡依靠鎢鹵素光源透射光的熒光激發(fā)短弧氣燈。廣角調(diào)查作為光源已經(jīng)推出了激光配置數(shù)量相對有限，但在光學(xué)顯微鏡，共聚焦和多光子顯微鏡的廣泛出現(xiàn)，大大增加了使用的激光器。因為信號 - 噪聲可能是在活細胞成像中收集數(shù)據(jù)的一個最重要的變量，試樣腔室必須具有非常高的光強度照射，以便最大限度地信號，并實現(xiàn)全分辨率的光學(xué)系統(tǒng)。然而，當通過100x物鏡的數(shù)值孔徑1.4集中在滿功率，100瓦汞弧光放電燈將嚴重影響哺乳動物細胞的生存能力，在短短的幾秒鐘。產(chǎn)生類似的損害時，細胞在全亮度照明與鎢鹵素?zé)艋螂瘹鉄粢暂^慢的速度，但高功率的激光器能夠破壞細胞，甚至速度比汞燈時。其結(jié)果是，影響試樣的光的強度必須被仔細的管理，考慮到強度和波長光譜。應(yīng)該用在活細胞成像實驗，只有有限部分的調(diào)查（實際上，熒光照明，光活化，光漂白等）是必要的頻譜。在幾乎所有情況下，光照水平和波長限制代表圖像質(zhì)量之間的妥協(xié)和維持細胞活力。

用于確定如果光照強度太高，最好的標準之一是觀察細胞是否進入并完成有絲分裂的實驗條件下。某些細胞，如胚胎，是比較耐可見光，可能是因為他們?nèi)狈υ?span style="font-family:Arial">DNA損傷反應(yīng)途徑逮捕分裂周期。然而，很多比較流行的哺乳動物細胞株，包括鼠袋鼠，豬腰，赤麂，以及最主要的文化，是對光線極其敏感。無論實驗采用的光源，過濾器應(yīng)安裝在光學(xué)路徑，甚至微量的紫外線和紅外線輻射的照明光，以防止污染。

盡管現(xiàn)代的帶通濾波器通常用于熒光成像在光譜的可見部分中的高的阻塞水平，他們?nèi)匀粌A向于通過一些非常低和高的波長的輻射。因此，它是明智的，安裝在光路中的廉價的玻璃過濾器，阻止上面的端部在可見光光譜的波長。這些額外的過濾器的應(yīng)用是特別重要的，因為它們與汞弧燈的紫外線產(chǎn)生非常高的水平。鹵鎢燈發(fā)出的紅外光的含量超標，需要紅外濾光片的所有活細胞調(diào)查。與此相反，氙燈產(chǎn)生少得多的紫外光，盡管它們在近紅外發(fā)射峰的日益流行的金屬鹵化物燈，而產(chǎn)生類似汞光譜線，在較長的波長具有較高水平的排放。

活細胞成像幾種常見的照明光源的光譜剖面圖7中。的水銀和金屬鹵化物燈中存在的明顯的峰在下面討論。的鎢鹵燈有一個配置文件，在紫外光譜區(qū)中的輸出產(chǎn)生相對小的，但在近紅外波長的整平之前逐漸增加。燈絲燈泡的相對功率輸出的是約25％的汞弧光放電燈，在可見光波長區(qū)域（550納米）的中心。對比汞燈，氙弧放電燈具有與大部分能量集中在800納米以上的波長在可見光區(qū)域的低功率輸出。但是，氙氣燈的輸出的檔案是連續(xù)的，在可見光波長比汞和金屬鹵化物燈。圖7中所示的所有的光源成像活細胞中發(fā)現(xiàn)顯著的實用程序。

對于對比度增強技術(shù)，在明視場模式下（主要是DIC，HMC，相位相反的）的成像單元中，最常用的光源是100瓦鎢鹵素?zé)?。在長期的實驗，這盞燈是特別穩(wěn)定，輸出波動（時間和空間）在正常工作條件下，只有輕微的程度。需要數(shù)百甚至數(shù)千張圖片，在一段較長的時間推移實驗，以確保增加的時間穩(wěn)定性，穩(wěn)壓電源可以安裝在系統(tǒng)上。通常情況下，這方面的努力是必要的實驗室環(huán)境，線路的功率是受頻繁電壓下降。在明場成像模式中的總光強度降低時，綠色或紅色的過濾器是用來阻止紫外線和藍光的波長保存細胞活力的目的。在許多情況下，一個546納米綠色的干涉被用于DIC和相襯，但更長的波長濾光器通常會工作，以及。請注意，一個綠色的干涉濾光器，在明場成像模式中校正色差的經(jīng)典使用現(xiàn)代先進螢石和復(fù)消色差的物鏡不再是必要的。

概括地說，照明源的波長范圍內(nèi)是最無害的試樣應(yīng)采用明場成像。廣泛的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大部分細胞有寬容一點紫外光和紅外光，是最敏感，其次是綠色和藍色至紅色波長。因此，從生物學(xué)的角度來看，它是合理使用紅色光（600到650納米）為活細胞的調(diào)查，只要有可能，即使波長較長迫使分辨率和妥協(xié)一些CCD相機在這個區(qū)域不敏感。的分辨率的問題比細胞生存力是不太重要的，通常限制在更大程度上由細胞內(nèi)部運動，溫度漂移和缺陷的光學(xué)和照明系統(tǒng)。相機感光度的限制正在迅速的制造商，他們都在努力設(shè)計更均勻地在整個可見光譜響應(yīng)解決。

短弧等離子燈的最高亮度和光彩輸出任何連續(xù)運行的光源和方法，非常密切的，一個點光源的理想模型。然而，強度比燈絲（鎢-鹵）燈，電弧放電燈具有顯著較大的波動，因為氣體等離子體本質(zhì)上是不穩(wěn)定的和受影響的受磁場電極的侵蝕。短期穩(wěn)定性主要是由三個工件的鎢電極之間產(chǎn)生的電弧的影響。電弧漂移發(fā)生時的圓弧的連接點上的圓錐形陰極前端面穿過的圓形圖案的電極中，通常會需要幾秒鐘移動一個完整的圓。 喇叭指的亮度變化的瞬間，當電弧重定位到新的在陰極上具有更高的電子發(fā)射質(zhì)量比以前的附著點的區(qū)域。對流電流之間的電弧的溫度差和包絡(luò)產(chǎn)生電弧撲表現(xiàn)為快速弧柱的橫向位移，這是由于在氙氣或汞蒸氣。除汞，金屬鹵化物電弧放電燈含有鹵素，如碘，溴，和操作中的一個過程被稱為鎢/鹵素循環(huán)的鹵素防止蒸發(fā)的鎢，由電極發(fā)射的墻壁上沉積的包絡(luò)，從而延長了燈泡的使用壽命和穩(wěn)定性。目前，這些光源是在熒光顯微鏡中產(chǎn)生的最優(yōu)選的照明光源。

從一個標準的汞燈（HBO 100瓦）的輻射輸出，只有45％是有用的熒光顯微鏡波長350至700納米之間。此外，大部分能量集中在突出的譜線在366納米（10.7％），436納米（12.6％），546毫微米（7.1％），和579納米（7.9％）。有用的輸出功率從XBO氙燈（75瓦），雖然在350至700納米范圍內(nèi)相對統(tǒng)一的，構(gòu)成大部分能量（約74％），居住總只有24.5％的近紅外波長較長。氙弧放電燈往往是采用廣泛的激發(fā)波長時是必需的。氙燈的光譜輸出的模擬太陽光，因為它提供了特征的激烈的寬帶沒有突出的線無論是在紫外光或可見光的波長區(qū)域的照明。

圖8中的一些最先進的照明光源，目前可用于活細胞成像。的金屬鹵化物燈（圖8（a））正迅速成為最通用的寬視場顯微鏡來源之一，經(jīng)常被銷售作為汞弧光放電燈的替代品。外部的氙氣燈室（圖8（b）和圖8（c））通常是耦合到一個準直透鏡，安裝在顯微鏡上的輸入端口通過單模光纖或者液體光導(dǎo)。最通用的光源是單色（圖8（D）），可以選擇特定波長的激發(fā)，但也是最昂貴的選擇。通常采用氙弧燈相似，的單色可以取代燈箱和激發(fā)濾光片輪，使極快的波長調(diào)諧在熒光顯微鏡?？傊?，照明選項，如圖8所示顯微鏡具有廣泛的選擇，可以適合大多數(shù)預(yù)算。

已花費了相當大的努力合成熒光團有最大吸收峰位于突出的汞譜線附近。例如，經(jīng)典的探針羅丹明Mitotracker有紅的吸收在546和579的汞線，分別以高效率的Alexa Fluor系列染料，而具有極大值對應(yīng)的大部分汞峰（350，405，440，546，和568）。了很多年，汞弧光放電燈是最普遍的熒光顯微鏡中的光源，但如上面所討論的，它們不提供均勻的照明領(lǐng)域，并在短的時間內(nèi)表現(xiàn)出較大的波動在輸出。這些工件都可以呈現(xiàn)顯著的問題，在定量分析的熒光。金屬鹵化物燈中含有類似HBO汞燈的光譜線，但也表現(xiàn)出非高峰強度約50％，更強大的。因此，并不強烈興奮峰汞燈發(fā)射光譜，如熒光的Alexa Fluor 488熒光團，與金屬鹵化物照明光源，產(chǎn)生明亮的圖像。此外，金屬鹵化物燈，汞燈，質(zhì)量，很容易檢測到與數(shù)碼相機相比產(chǎn)生更均勻的輻照度。氙氣燈，雖然不亮，也更穩(wěn)定，比汞燈和提供幾乎恒定勵磁照明在整個可見光譜的熒光基團。為了克服與電弧放電燈的非均勻照明的問題，液體光導(dǎo)（下面討論）可以被利用耦合燈箱顯微鏡輸入端口。通過散射的光通過導(dǎo)光產(chǎn)生一個更均勻的領(lǐng)域。輸出的時間波動是更難以控制，但已經(jīng)與最成功的反饋機制，控制輸入功率的燈。

傳輸和熒光顯微鏡活細胞成像通常配置科勒照明下進行操作。這種普遍的照明方案，用于均勻地照明的圖象場的空間復(fù)雜的來源（電弧放電或鹵鎢燈）只在傳輸模式中的聚光鏡或物鏡的后焦平面的焦平面的源程序的一部分，由成像落射熒光模式。引人注目的標本甚至是源光，雖然這光從所有可能的方位與公平分配可能無法到達。該字段的光圈（有效的是在中間像平面）成像到樣品上，以限制在不影響照亮區(qū)域的照明光的角度。在高度非均勻的情況下，擴散過濾器也可以使用位于焦平面上的均勻性進一步提高。科勒照明是不是最有效的系統(tǒng)，因為它不使用的完整的源極或發(fā)射的光的角分布，表面。然而，在顯微鏡配備只有一個燈箱，飼料直接送入聚光鏡系統(tǒng)的照明，科勒照明顯微鏡對準仍然是最佳選擇。

雖然科勒照明系統(tǒng)的功能，以確保均勻的照明，并控制它的連貫性，但也可以使用光導(dǎo)，以實現(xiàn)均勻的照明。爭先恐后的光，有效地降低其空間和時間的連貫性，也通過光導(dǎo)應(yīng)用。一個光源耦合到顯微鏡的同時也降低的連貫性，使用最廣泛的和實用的方法，是將光聚焦成一個靈活的長度的單模光纖或者液體光導(dǎo)（參見圖9）。熱運動中的液體光導(dǎo)不斷改變光路和光的散射，使空間和時間的連貫性，有效地消除。在盤繞單模光纖的情況下，包層的反射不斷地改變，因為光纖稍微彎曲，產(chǎn)生一個射出光束，實際上是均勻的強度在時間和空間。在加擾的光纖維（在高達100千赫茲的頻率）的振動的技術(shù)也是有效的。輕相炒，由于路徑長度不同的光波通過光纖輻射和高單色性，雖然被保留。射出光束是由頂帽的強度分布而不是高斯分布的激光的有特征的描述。為了避免可能的熱損傷的光的加擾器，紅外輻射以及其他不需要的發(fā)射波長應(yīng)被刪除，才能進入光纖或光導(dǎo)。在理想的情況下，只有圖像形成的關(guān)鍵的波長應(yīng)該留下的光源（光纖和液體光導(dǎo)傳輸?shù)臋n案都在圖9中）。，而不是依賴于寬帶鏡，冷鏡和帶通干涉濾光片應(yīng)選擇光圈磁盤傳輸?shù)墓獾牟ㄩL，并允許不必要的熱量逃脫。

使用液體光導(dǎo)的一個關(guān)鍵問題，或在顯微鏡的光纖的外部光源燈輸出到光纖的耦合效率。大多數(shù)光纖的數(shù)值孔徑在0.2和0.55之間，并且該值應(yīng)相匹配的源收集的光學(xué)。一些制造商提供設(shè)計實施在滿足此條件的液體光導(dǎo)燈室。在旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡，掃描機制采用的照明方法，填補了后孔的物鏡。可用的來自光源的光耦合到試樣是一些涉及在非激光的情況下，因為信息源，例如弧光燈輻射到一個球體，而不是產(chǎn)生平行光束。因此，反射鏡所需的直接光從背面向試樣的圓弧。的不需要的波長，例如紅外線和紫外線，可以被允許通過一個紅外線發(fā)射器被表示為冷反射鏡和紫外線發(fā)射器的熱鏡）的二色性反射鏡（和燈殼體中的被吸收。通過冷反射鏡的熱耗散減少源的機械和光學(xué)部件的熱膨脹引起的運動。在各種形式的顯微鏡，鏡頭靠近熱源來源必須安裝適當?shù)脑试S熱膨脹。各種售后光源夫婦顯微鏡外部光源（通常是氙氣金屬鹵化物）通過光纖或液體光導(dǎo)（見圖8）。此外，專門單色器提供精確的波長選擇。雖然價格不菲，這些器件提供了一個很好的替代定量顯微鏡。應(yīng)接近最終行使選擇合適的照明光源和波長區(qū)域為活細胞成像的理解是，高強度的光，任何顏色本質(zhì)上是有害的活細胞。無論是否進行了優(yōu)化的波長范圍內(nèi)，光源必須在任何時候都關(guān)閉了，除了當圖像被收購。

活細胞成像軟件

設(shè)計用于光學(xué)顯微鏡的數(shù)碼相機一般都連接到主機計算機工作站，它允許用戶調(diào)整相機設(shè)置，預(yù)覽標本，收集圖像，并存儲在調(diào)查過程中收集的數(shù)據(jù)。在流行的攝像頭接口總線是火線（IEEE-1394），通用串行總線（USB），傳統(tǒng)的串行端口（RS-422），小型計算機系統(tǒng)接口（SCSI），所支持的廣泛的專有接口攝像機專用集成電路板插入到計算機中?；罴毎麍D像采集專用的計算機將需要快速的微處理器和一個顯著的隨機存取記憶體量，以及足夠的硬盤空間來存儲圖像和數(shù)據(jù)。該建議的出發(fā)點是3千兆赫（千兆赫）處理器和至少1千兆字節(jié)（GB）的內(nèi)存。硬盤驅(qū)動器的價格相對便宜，所以工作站應(yīng)該有一個或多個250 GB驅(qū)動器和一個高性能的圖形卡將顯著受益。用于將數(shù)據(jù)寫入光盤（CD）或數(shù)字通用光盤（DVD）的磁盤驅(qū)動器還建議。顯示器應(yīng)該是一個高分辨率的平板，節(jié)省桌面空間，并提供明亮，銳利，圖像無閃爍。

與大多數(shù)數(shù)碼相機系統(tǒng)提供的圖像采集軟件，是用來調(diào)整相機設(shè)置，如增益，偏移，曝光時間，和分級。一些更復(fù)雜的產(chǎn)品的也能夠執(zhí)行圖像處理任務(wù)的不同程度，包括亮度，對比度和灰度的控制，添加偽彩色，圖像合并，創(chuàng)建疊加層，并產(chǎn)生數(shù)字視頻序列。收購后的圖像分析，反褶積，和復(fù)雜的測量，以及額外的硬件（如濾光輪，遮光器，z軸驅(qū)動器，載物臺等）必要的總量控制，最先進的軟件套件將提供廣泛的工具自動活細胞成像。驅(qū)動程序可從兩個攝像頭和軟件制造商，幾乎每一個型號的數(shù)碼相機的圖像采集和顯微鏡控制軟件程序接口。此外，許多相機廠商也為專門的功能集成到攝像頭的驅(qū)動軟件編程感興趣的研究人員提供軟件開發(fā)工具包?，F(xiàn)代激光共聚焦顯微鏡都配有軟件比使研究者能夠立即分析結(jié)果，從實驗，包括共定位，光漂白，共振能量轉(zhuǎn)移，光活化，以及各種其他技術(shù)。定制的活細胞成像配置選擇軟件時，研究者應(yīng)該考慮一個包，允許最大的靈活性，設(shè)計實驗。

結(jié)論

活細胞成像的光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)在配置載物臺，要記住的最重要的考慮，是一種妥協(xié)，必須經(jīng)常保持細胞可行，實現(xiàn)了最佳的時間和空間分辨率之間。最商業(yè)化的顯微鏡的設(shè)計，以達到盡可能高的圖像質(zhì)量，但不一定配置保持健康的細胞培養(yǎng)。然而，仔細規(guī)劃，標準的現(xiàn)成顯微鏡可以很容易地改裝成一個真正的活細胞成像系統(tǒng)?；究紤]是標本室，焦點漂移，數(shù)碼相機系統(tǒng)，照明光源，遮光器，過濾組合，振動補償，和軟件接口整個系統(tǒng)成為一個有凝聚力的單位。雖然有許多替代品在前面的章節(jié)中討論的系統(tǒng)，在眾多的調(diào)查，在這次審查中所描述的概念已被證明其效用。