尼康顯微鏡：熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)

由有機和無機樣品的光的吸收，隨后再輻射通常是既定的物理現(xiàn)象作為熒光或磷光的結(jié)果。通過光的發(fā)射熒光過程幾乎是同時地吸收的激發(fā)光的光子的吸收和發(fā)射，取值范圍通常小于一微秒的持續(xù)時間相對較短的時間之間的延遲。當發(fā)射仍然存在更長的時間后已經(jīng)熄滅的激發(fā)光，該現(xiàn)象被稱為磷光。

首先描述英國科學家喬治爵士G.斯托克斯于1852年，是負責這一術(shù)語時，他觀察到的礦物螢石發(fā)出紅光，當它被照亮的紫外線激發(fā)熒光。斯托克斯指出，總是發(fā)生在比激發(fā)光的波長更長的熒光發(fā)射。在19世紀早期的調(diào)查表明，當用紫外線照射時，許多標本（包括礦物，晶體，樹脂，生藥，黃油，葉綠素，維生素，和無機化合物）熒光。然而，直到20世紀30年代開始使用熒光染料染色的組織成分，細菌和其他病原體的生物調(diào)查。幾個這些污漬具有較高的特異性，刺激的熒光顯微鏡的發(fā)展。

熒光顯微鏡技術(shù)在生物學和生物醫(yī)學科學，以及在材料科學，由于在其他對比度模式與傳統(tǒng)的光學顯微鏡不容易獲得的屬性已經(jīng)成為一個必不可少的工具。數(shù)組的熒光染料中的應(yīng)用已成為可能，以確定細胞和細胞成分亞微觀非熒光材料具有高度的特異性之中。事實上，在熒光顯微鏡能夠揭示單個分子的存在下。通過使用多個熒光標記，不同的探針可同時識別多個物鏡分子同時進行。雖然在熒光顯微鏡不能提供低的空間分辨率的衍射極限的特定試樣的功能，低于該范圍內(nèi)的熒光分子的檢測，可以容易地獲得。

各種標本表現(xiàn)出的自體熒光（不含熒光染料的應(yīng)用），當他們被照射，這種現(xiàn)象已徹底在植物學，巖石學，半導(dǎo)體產(chǎn)業(yè)等領(lǐng)域的利用。相比之下，動物組織和病原體的研究往往是復(fù)雜的，要么極其暗淡或明亮的，非特異性的自發(fā)熒光。更大的值，后者的研究的是，加入的熒光染料（也稱為熒光團），特定波長的光照射被激發(fā)并發(fā)光定義的和有用的強度。熒光染料污漬依附可見光或子可見的結(jié)構(gòu)，往往是高度特異性的針對自己的依戀，有一個顯著的量子效率（比吸收光子發(fā)射）。利用熒光顯微鏡的廣泛增長是密切相關(guān)的新的合成的和天然的與已知的強度分布的激發(fā)和發(fā)射熒光團的發(fā)展，以及很好理解的生物物鏡。

激發(fā)和發(fā)射基礎(chǔ)

熒光顯微鏡的基本功能是有所需的和特定頻帶的波長照射試樣，然后分離出更弱的發(fā)射熒光的激發(fā)光。在適當配置的數(shù)字顯微鏡，只的發(fā)射光到達眼睛或檢測器，使所得到的熒光結(jié)構(gòu)疊加有高對比度和（或黑色）的一個非常黑暗的背景。一般的檢測限受黑暗的背景下，激發(fā)光通常是幾十萬到一百萬次發(fā)出的熒光亮度比。

在圖1所示的是一個現(xiàn)代的兩個發(fā)射和反射熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡的剖面圖。在該圖的中心的垂直照明器具有在其一端（標記的落射燈箱）和過濾器立方體炮塔的另一位置的光源。該設(shè)計包括一個基本的顯微鏡，其中反射光的反射光的波長長于激發(fā)。約翰S. Ploem入賬垂直照明反射光熒光顯微鏡的發(fā)展。在熒光垂直照明，光的特定波長（或定義的波長帶），經(jīng)常在紫外，藍色或綠色區(qū)域的可見光譜，通過來自光源的電弧放電燈或其他源通過一個多光譜激發(fā)波長選擇性的過濾器。通過激發(fā)光濾光片的波長反映從一個二色反射鏡或分束器（也稱為二向色性）的表面上，通過顯微鏡的物鏡浴中的試樣強烈的光線。如果樣品發(fā)出熒光，通過由物鏡聚集的發(fā)射光通過二色鏡，隨后過濾通過一個勢壘（或發(fā)射）濾波器，該濾波器阻止不需要的激發(fā)波長。重要的是要注意，熒光試樣，激發(fā)后，產(chǎn)生自己的光在光學顯微鏡下是唯一的模式。所發(fā)出的光在所有方向上，球的再輻射的激發(fā)光源方向無關(guān)。

落射熒光照明是壓倒性的選擇技術(shù)在現(xiàn)代顯微鏡，觀察觀察鏡筒和物鏡轉(zhuǎn)換器殼體的物鏡之間的反射光垂直照明。所述照射器被設(shè)計為直接光照射到試樣上，首先通過的激發(fā)光通過顯微鏡物鏡（在此配置中，作為一個聚光鏡）的方式向試樣，然后使用相同的物鏡，以捕獲發(fā)射的熒光。這種類型的照明器具有幾個優(yōu)點。作為校正聚光鏡和第二服務(wù)第一作為圖像形成的光收集者的熒光顯微鏡的物鏡。作為一種單組分，物鏡/聚光鏡總是完美對齊。達到試樣的激發(fā)光的大部分通過無相互作用，行駛相差的物鏡，和被照射區(qū)域被限制為（在大多數(shù)情況下）通過目鏡觀察。不像一些對比增強技術(shù)的情況，全面客觀的數(shù)值孔徑是科勒照明顯微鏡時，而正確的配置。最后，它是可能的結(jié)合，或交替使用反射光的熒光和透射光觀察和捕獲的數(shù)字圖像。

如在圖1中，反射光垂直照明器包括一個電弧放電燈管外殼的后端處（通常是一個汞或氙氣燃燒器）。激勵光沿垂直照射器，通過的集電極透鏡和一個變量，定心的孔徑光闌，然后通過一個變量，定心的視場光闌（參見圖1）通過顯微鏡的光軸。然后，光入射激發(fā)光濾光片選擇所需的波段和不需要的波長阻塞發(fā)生。所選擇的波長，通過激發(fā)濾光片后，達到的二色性分束鏡，這是一個專門的干涉濾光器，可以有效地反射波長更短的光有效地通過較長波長的光。二色性分束器在相對于接收到的激勵光成45度的角度傾斜時，這反映了在一個90度角，直接通過物鏡光學系統(tǒng)，和到標本的照明。由物鏡收集被照射試樣所產(chǎn)生的熒光發(fā)射，在其通常的圖像形成功能的服務(wù)。因為所發(fā)射的光由較長的波長比激發(fā)照明，它是能夠通過二色鏡上方觀察管或電子檢測儀。

達到的二色鏡的激發(fā)光的散射反射回光源，雖然分鐘數(shù)量往往穿過并吸收由反射鏡塊的內(nèi)部涂層。發(fā)出的熒光可以到達目鏡或探測器之前，它必須首先通過通過屏障或抑制濾波器。該過濾器塊（抑制）的任何殘余激勵光，并傳遞所需的較長的發(fā)射波長。在大部分的反射光照明裝置中，激發(fā)濾光器，二色鏡，和屏障過濾器引入到一個光學塊（通常稱為作為一個多維數(shù)據(jù)集），如在圖2中示出?，F(xiàn)代熒光顯微鏡能夠容納四至六名熒光的多維數(shù)據(jù)集（通常在一個旋轉(zhuǎn)的炮塔或通過滑塊機構(gòu);見圖1），并允許用戶輕松地將更換售后激發(fā)和屏障過濾器，以及雙色鏡。

垂直照明設(shè)計應(yīng)該使用戶能夠調(diào)整顯微鏡科勒照明，提供明亮，均勻的照明，光圈在整個視野。的聚光透鏡的光學系統(tǒng)的校正應(yīng)確保定心孔徑光闌的圖像共軛的后孔徑集中的物鏡。預(yù)聚焦，定心視場光闌的形象在現(xiàn)代照明，重點標本和固定目鏡膜片的平面共軛。

照明燈箱通常采用紅外光抑制濾波器。燈箱本身不會泄漏有害的紫外線的波長，優(yōu)選地，應(yīng)設(shè)有一個開關(guān)自動關(guān)閉燈泡殼體在操作過程中不經(jīng)意地打開。燈箱應(yīng)該堅固，足以承受一個可能在操作過程中爆炸燃燒器（弧光放電燈）。的燈座在現(xiàn)代lamphouses的，配備有調(diào)節(jié)旋鈕，以允許中心的弧光燈的圖像內(nèi)的物鏡（科勒照明光學系統(tǒng)中，這些平面是共軛）的后孔。在光路中，通常接近燈箱和激發(fā)濾光片前的某處，它是試樣時，不被觀看或與檢測器成像，以完全阻止激發(fā)光，希望有一個快門。此外，中性密度濾光片的規(guī)定應(yīng)當提供（無論是在車輪上，轉(zhuǎn)塔，或滑塊），以使用戶以減少的激勵照明的強度。

斯托克斯位移

放松當電子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，振動能量損失。的能量損失的結(jié)果，激發(fā)熒光團的發(fā)射光譜通常轉(zhuǎn)移至較長的波長相比的吸收光譜或激發(fā)光譜（注意，波長成反比的輻射能量）。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯定律或斯托克斯位移記錄。斯托克斯位移值增加，它變得更容易分離發(fā)射光激發(fā)，通過使用熒光濾光片組合。

的熒光發(fā)射（或吸收）的強度峰值的波長和幅度比通常較低，所表現(xiàn)出的激發(fā)峰，發(fā)射光譜輪廓（曲線）是通常的鏡像圖像（或接近）的勵磁曲線，但轉(zhuǎn)移到較長的波長，如圖3中所示的Alexa Fluor 555，一個有用的探針的黃綠色區(qū)域中吸收光，產(chǎn)生橙黃色發(fā)射。通常，為了實現(xiàn)最大熒光強度，熒光團（通常稱為染料）或激發(fā)曲線的峰值波長附近的激發(fā)，并盡可能廣泛的包括發(fā)光峰的發(fā)光波長的選擇的檢測。激發(fā)和發(fā)射波長的選擇通常是基于干涉濾光器（圖2）。此外，顯微鏡光學系統(tǒng)的光譜響應(yīng)也將取決于玻璃的傳輸效率（由于防反射涂層），透鏡和反射鏡元件的數(shù)目，和檢測器系統(tǒng)的響應(yīng)度等因素。

激發(fā)和發(fā)射波長的有效分離和檢測的實現(xiàn)在熒光顯微鏡中，通過適當選擇過濾器，以阻止或通過特定波長帶中的紫外線，可見光和近紅外光譜區(qū)。，平衡器）向試樣的方式插入到光路中，并再次在檢體之間的路徑和控制的應(yīng)用，容易地更換過濾器（中性密度和干擾激發(fā)的激發(fā)光通過的目的而設(shè)計的熒光的垂直照明器觀察管或相機檢測系統(tǒng)。也許最重要的標準，在相對低的熒光發(fā)射強度（見上面的討論），是用于激發(fā)光源是足夠的亮度，可以最大化的弱的發(fā)光，并且，熒光染料具有足夠的吸收性能和發(fā)射量子產(chǎn)率。

的效率的特定熒光團的激發(fā)光的吸收一個光子的分子橫截面是一個函數(shù)，被稱為消光系數(shù)和吸收的可能性。更大的消光系數(shù)，在一個給定的波長區(qū)域的吸收一個光子（或量子）是更有可能的。的量子產(chǎn)率表示的量子數(shù)之比，發(fā)射出比吸收（通常是在0.1和1.0之間的一個值）。低于1的量子產(chǎn)率的值是通過非輻射的途徑，如熱或光化學反應(yīng)，而不是重新輻射通路的熒光能量的損失的結(jié)果。消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，平均的光源的發(fā)光強度，熒光壽命的熒光發(fā)射的強度和效用都是重要的因素。

衰退，淬滅，漂白

寬譜的條件往往開始發(fā)揮作用，最終影響到重熒光發(fā)射的輻射，從而降低強度。熒光強度降低的總稱衰落，一個包羅萬象的所有類別，通常是進一步細分為更精確的描述淬火和漂白現(xiàn)象。光漂白，因為它們的相互作用與分子氧在發(fā)射前是處于激發(fā)態(tài)的熒光分子的不可逆分解。漂白的發(fā)生被利用的技術(shù)稱為熒光漂白后恢復(fù)（FRAP），一個非常有用的機制，為研究生物大分子的擴散和運動。該方法是基于漂白后大幅定義區(qū)域的標本由強烈的激光脈沖，伴隨著隨后的觀察光漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)的速率和模式。一個相關(guān)的技術(shù)，被稱為熒光漂白損失（FLIP），熒光監(jiān)測減少躺在相鄰的光漂白區(qū)域定義的區(qū)域。類似的FRAP，后者的技術(shù)是有用的在活細胞中的分子運動性和動力學調(diào)查。

圖4展示的是光漂白（衰落）中觀察到的一系列為乘法染的文化印度人麂鹿表皮的成纖維細胞的在不同時間點拍攝的數(shù)字圖像的一個典型例子。雙 - 苯并咪唑衍生物（Hoechst公司33258，藍色熒光）的細胞核進行染色，而在線粒體和肌動蛋白細胞骨架與MitoTracker紅CMXRos（紅色熒光）和鬼筆環(huán)肽衍生物，共軛的Alexa Fluor 488（綠色熒光）的染色分別。時間點在兩分鐘的時間間隔，用熒光過濾器組合與調(diào)整，激發(fā)熒光基團，同時也記錄合并發(fā)射信號帶寬。請注意，所有三個熒光團具有相對高的強度在圖4（a），但的Hoechst熒光強度（藍色）開始快速下降，在兩分鐘內(nèi)，在6-8分鐘內(nèi)幾乎完全消失了。線粒體和肌動蛋白的污漬更耐漂白，但兩者的強度顯著下降的過程的時間序列（10分鐘）。

通過各種機制涉及非輻射能量損耗和經(jīng)常發(fā)生降低的熒光強度的猝滅結(jié)果激發(fā)態(tài)的弛豫過程作為氧化劑或鹽或重金屬或鹵素化合物的存在下的結(jié)果。在某些情況下，淬火的能量傳遞到另一個分子（稱為受體），這是位于物理上接近的激發(fā)的熒光基團（供體），這種現(xiàn)象被稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的結(jié)果。這種特殊的機制，已成為一種有用的技術(shù)，涉及距離遠低于光學顯微鏡的橫向分辨率的分子間的相互作用和關(guān)聯(lián)的研究的基礎(chǔ)。

熒光光源

排放水平低，在大多數(shù)熒光顯微鏡應(yīng)用的一個不幸后果是，到達眼睛或相機探測器的光子數(shù)也非常低。光學顯微鏡的收集效率，在大多數(shù)情況下，是小于30％，許多熒光基團的濃度在微摩爾或納摩爾地區(qū)范圍的光路中。為了產(chǎn)生足夠的激發(fā)光的強度產(chǎn)生檢測到的排放量，強大的緊湊的光源，如高能量的短弧放電燈，是必要的。最常見的燈的汞的燃燒器，在瓦數(shù)范圍從50至200瓦，氙氣燃燒器，從75至150瓦的范圍內(nèi)（參見圖5）。這些光源通常采用外部直流電源，家具足夠的啟動電源，通過電離的氣態(tài)蒸氣點燃燃燒器，保持它閃爍最低燃燒。

在顯微鏡弧放電燈的外部電源通常是配備一個帶有計時器，跟蹤燃燒器已經(jīng)在運行的小時數(shù)?；」鉄簦バ屎透菀姿榱?，如果使用超出其額定壽命（200-300小時）。汞燃燒器不提供均勻的強度在整個頻譜從紫外到紅外燈泡的強度大部分花費在近紫外。突出強度峰值出現(xiàn)在313，334，365，406，435，546和578納米。在其他波長在可見光區(qū)域，強度穩(wěn)定，但幾乎沒有這么亮（但在大多數(shù)應(yīng)用中仍然可用）。在考慮發(fā)光效率，光燈的瓦數(shù)是不是首要的考慮因素。取而代之的是，關(guān)鍵的參數(shù)是必須加以考慮的平均亮度，同時考慮到發(fā)射源的亮度，弧線的幾何形狀，角度擴展。

在過去的幾年中，光學顯微鏡經(jīng)歷了增加在應(yīng)用程序中的激光光源，尤其是氬離子，氪氬離子激光器。這些激光源尺寸小，低發(fā)散，近monochromicity，平均亮度高的優(yōu)點。他們已成為在掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，這種技術(shù)已被證明是一個強大的工具，在渲染非常尖銳的熒光圖像，通過拒絕非聚焦光除去試樣焦平面至關(guān)重要。通過點或線重合通過復(fù)合孔徑成像掃描共聚焦顯微鏡完成這個任務(wù)。的標本的光學部分可以被存儲在一個主計算機，并重構(gòu)為最終的圖像，然后將其顯示在監(jiān)視器上。

過濾器術(shù)語

作為一個結(jié)果，利用由不同的制造商，以確定他們的過濾器的各種縮寫和代碼混亂已成為常見的術(shù)語適用于熒光顯微鏡的功能組合?；旧嫌腥箢愡^濾器：激勵（通常簡稱為勵磁），障礙（排放），兩色分光鏡（或分色鏡）。熒光過濾器以前幾乎完全從染色玻璃或明膠夾在兩個玻璃板之間的構(gòu)造。然而，目前的趨勢是制造高清晰度干擾光學激發(fā)濾光片過濾器與一個偉大的特異性和高傳輸?shù)牟ㄩL的光通過或拒絕。雙色分光鏡是專門旨在反映或通過特定波長的光時，放置在一個45度角（見圖1和圖2）入光路的干擾濾波器。阻擋過濾器制造與有色玻璃或干擾涂料（或兩者的結(jié)合）。

制造商雇用的縮寫識別激發(fā)濾光片的屬性包括：UG（紫外線玻璃）和BG（藍色玻璃）。往往表示Shortpass過濾器KP（K表庫爾茲，德語的意思是“短”的縮寫），或簡稱為SP?，F(xiàn)在，一些制造商的標簽指定IF干擾濾波器。窄帶激發(fā)干涉濾光片是特別有用的，如果斯托克斯轉(zhuǎn)變是小。

縮略語或縮寫阻隔過濾器包括：LP或L長通濾波器，為黃色或蓋爾布（德國）的玻璃，?或RG紅色玻璃，OG或?橙色的玻璃，K表坎特，德國術(shù)語邊緣?或GG（過濾器），以及BA屏障過濾器。當過濾器的類型也與一個數(shù)字，如BA515，該指定是指，在50％的它的最大傳輸?shù)牟ㄩL（納米）。

雙色分光鏡還包括CBS在內(nèi)的眾多縮寫所描述的一個色分束器，DM分色鏡，TK “teiler坎特”，德國為“teiler FARB” 邊緣分離器，FT（德國顏色分配器），和RKP反思短傳。所有這些術(shù)語應(yīng)該被認為是可以互換的，現(xiàn)代的二色性分束器總是與干擾涂層的光學玻璃（如有機或金屬染料相對）制造的。更長的波長更短的波長和高的傳輸?shù)哪康氖钱a(chǎn)生高反射率的薄膜的干擾。二色性分束器在一個45度角進入光學塊的激發(fā)光，通過反射光熒光照明器的路徑取向。它們的主要功能是重新定向選擇的激勵（較短的）波長通過物鏡到標本。在這些專門的過濾器也有通過較長波長的熒光發(fā)射的屏障過濾器，并反映在燈箱的方向的任何散射的激發(fā)光反射回的附加功能。

圖6給出了一個典型的熒光現(xiàn)代顯微鏡中使用的過濾器的組合的傳輸?shù)臋n案。激發(fā)濾光片光譜（紅色曲線）表現(xiàn)出高的水平（約75％），在450和490納米與470納米的中心波長（CWL）之間傳輸。二色鏡（黃色曲線）反映了在該區(qū)域的激發(fā)光譜的波長，通過較高和較低的波長時，以相對較高的效率。需要注意的是0％的透射二色鏡曲線上對應(yīng)于100％的反射。的突出浸在450和500納米，這表示峰的反射率之間的傳輸特性文件，用于反映通過在一個90度的角度，到樣品上的激發(fā)光濾光片的波長頻帶。中的最終組件的光的列車，排放量或屏障過濾器（白色曲線），發(fā)射波長在的綠色可見光區(qū)域，在520和560納米之間的范圍內(nèi)。的各種疊加的光譜的透射和反射的波長帶之間的界限被設(shè)計成盡可能陡峭的反射和透射的波長，以確保幾乎完全分離。正弦上升沿和下降沿尖峰出現(xiàn)在二色鏡光譜的圖案，是一種常見的薄膜沉積過程被稱為振鈴效應(yīng)。過濾器組合的表現(xiàn)，這是顯著的，并，實現(xiàn)薄膜 干涉濾光片技術(shù)的迅速發(fā)展，是一個明確的示范。

尼康所采用的過濾器的命名源于條款可以追溯到20世紀90年代初的混合物。當時，所有的尼康互補濾波器組合使用硬涂層濺射技術(shù)，但許多目前可用的過濾器利用新型柔軟的涂層方法生產(chǎn)。雖然軟大衣更容易受到濕度和熱降解，且必須更仔細地處理比硬涂層過濾器，他們表現(xiàn)出更高的阻擋光密度值，，微調(diào)特定波長頻帶，并提供更大的方便。了解尼康過濾器組合代碼命名規(guī)則提供了一種機制，迅速 確定是否特定的一組特定的熒光將充分履行。

尼康專有的字母數(shù)字濾波器的指定代碼的第一個字母表示的波長的激發(fā)光譜區(qū)域（例如，UV，V，B，和g，這是簡單的縮寫紫外線，紫色，藍色，綠色，分別）。激發(fā)后的代碼的數(shù)量涉及激發(fā)濾波器的通帶的寬度：1中和寬的頻帶激勵的窄頻帶激勵，2，和3很寬的頻帶激勵。最后，一個或多個字母的激發(fā)帶通大小號碼標識的屏障過濾器的特點。代碼字母à表示一個標準的長通屏障過濾器以最低的截止波長，而乙指定較高的臨界波長值一個長波發(fā)射濾波器的。帶通發(fā)射濾波器中帶有字母的ê（指“增強”），表明其優(yōu)越的性能方面，以消除交叉。E / C濾波器是柔軟的毛發(fā)干擾組合設(shè)計特異性探針，如DAPI，FITC，TRITC，州和得克薩斯州紅獲得最佳性能。

熒光預(yù)算

在一個典型的熒光顯微鏡的光束估計是有用的概述生產(chǎn)數(shù)字圖像，或在視覺上觀察標本時會遇到的約束。在本練習中，假設(shè)激勵源，是一個標準的75瓦氙放電燈的平均光通量密度約400坎德拉每平方毫米（其他來源，見表1）。當燈泡的輸出被收集并引導(dǎo)通過一個490納米的干涉濾光器（具有10納米的帶寬和75％的透射），約2毫瓦的光通過。由二色鏡，一個90％的效率為1.8毫瓦的光束反射后的顯微鏡物鏡作為激發(fā)光束進入后孔。

隨著100x物鏡的數(shù)值孔徑為1.4的試樣照明系統(tǒng)的面積將是12×10×E（-6）平方厘米，假設(shè)一個圓形，直徑約40微米的視圖字段。在試樣上的光束，然后約每平方厘米150瓦，它對應(yīng)的磁通密度為3.6×10×E（20）每平方厘米的光子。因此，試樣的光照強度是在一個陽光明媚的日子，事件對地球表面約1000倍以上。

上面所討論的，光束的結(jié)果依賴的熒光發(fā)射的熒光團的吸收和發(fā)射特性，它的濃度在試樣和試樣的光路長度。在數(shù)學方面，產(chǎn)生的熒光（F）由下式給出：

F =σ×Q×I

其中σ是分子的吸收截面，Q是的量子產(chǎn)率，I是入射光束（按上述方式計算）。假設(shè)熒光素的熒光團的吸收截面（σ）為3×10×E（-16）平方厘米每分子，Q等于0.99，所得的值F的每分子每秒100000光子。如果染料濃度為1微摩爾每升，均勻地分布在40微米直徑的盤，其厚度為10微米（體積等于12微微升），約1.2×10×E（-17）摩爾的染料或7.2萬分子在光路中。如果所有的分子同時被激發(fā)的熒光發(fā)射率是7.2×10×E（11）的光子每秒（F和數(shù)量的染料分子的商品）。利息問題是多少發(fā)出的光子將被檢測到，上述排放率可以繼續(xù)多久？

選擇光源的發(fā)光密度

表1

檢測效率的光的收集效率和檢測器的量子效率是一個函數(shù)。甲1.4數(shù)值孔徑以100％的傳送物鏡（一個不切實際的條件），有一個最大的收集效率，大約30％的接受角限制。二色鏡的傳輸效率的屏障過濾器的85％和80％。全面收集效率約20％或140億光子每秒。如果檢測器是一個傳統(tǒng)的電荷耦合器件（CCD），綠色熒光發(fā)射（525納米）的量子效率是50％左右，所以檢測到的信號將有70億光子每秒約10％的發(fā)射熒光。即使有一個完美的檢測器（100％量子效率），只有大約20％的熒光發(fā)射的光子可以被檢測到。

熒光發(fā)射的持續(xù)時間依賴于熒光基團的破壞率作為漂白結(jié)果。熒光在含氧生理鹽水溶液，測量結(jié)果表明，每個分子只能被銷毀之前發(fā)出約36,000光子。在無氧的環(huán)境中，光破壞的速度減少約10倍，所以每360,000光子熒光分子。整個染料池，在該示例（720萬的分子），然后將能夠產(chǎn)生一個最小為2.6×10×E（11）及最大為2.6×10×E（12）的光子。假設(shè)上述計算每個分子每秒100,000個光子的發(fā)射率，熒光可能持續(xù)僅0.3?3秒前光破壞。在被檢測到的光子通量的10％的情況下，為7.2×10×E（10）電子每秒信號將通過以下方式獲得。

按照本實施例的參數(shù)，如果檢測器是一個1000×1000像素的CCD相機，該信號將被分布超過一百萬的傳感器，每個傳感器約72,000電子。對于一個科學級CCD與9微米見方的傳感器，全井的存儲容量大約是80,000個電子和讀出噪聲小于10個電子。將在很大程度上取決于該signal-to-noise比等于光子統(tǒng)計噪聲信號的平方根，約268。在幾乎所有的情況下，這種高信號電平只能持續(xù)一個非常簡短的一段時間，光破壞發(fā)生之前。大多數(shù)的顯微鏡利用的妥協(xié)，以延長觀察期內(nèi)是減少在入射光束的強度，以便只在染料池的熒光團分子的一小部分被激發(fā)，并進行光破壞。因此，信號 - 噪聲比很少等于理論上的最大值，并通常在熒光顯微鏡中的10和20之間的范圍內(nèi)。

單分子檢測

在理想的條件下，它往往是未能檢測到的熒光發(fā)射，其前提是從一個單一的分子的光的背景和檢測器的噪聲是足夠低的。正如上面所討論的，單一的熒光分子可能會釋放出多達30萬的光子被摧毀前漂白。假設(shè)有20％的收集和檢測效率，約60,000光子將被檢測到。雪崩光電二極管或電子倍增CCD探測器，這些實驗中，研究者已經(jīng)能夠監(jiān)控許多秒甚至幾分鐘的單個分子行為。主要的問題是足夠的光抑制背景噪聲。因為許多建設(shè)顯微鏡鏡頭和過濾器所用的材料顯示某種程度的自體熒光，最初努力朝向非常低的熒光元件的制造。然而，它很快變得明顯，熒光顯微鏡技術(shù)，利用全內(nèi)反射（TIR）低背景和高激發(fā)光通量提供所需的組合。

全內(nèi)反射熒光顯微鏡（全內(nèi)反射熒光顯微鏡）利用漸逝波，所開發(fā)的光時，具有不同的折射率的兩種介質(zhì)之間的界面處的全內(nèi)反射。圖7（a）中示出的原理，采用外部光源。在這種技術(shù)中，光束的光（通常是一個擴展的激光束）被引導(dǎo)通過棱鏡的折射率高，如玻璃或藍寶石，緊靠低折射率介質(zhì)的玻璃或水溶液。如果光被引導(dǎo)到以高于臨界角的棱鏡，光束將被全內(nèi)反射的界面處。反射現(xiàn)象的發(fā)展的界面處滲透到約200納米或更小的折射率低的空間的電磁場產(chǎn)生的漸逝波。倏逝波的光的強度足夠高內(nèi)激發(fā)出熒光，但由于其深度較淺，興奮的是非常小的體積。因為這么少的試樣接觸到的激發(fā)光（只有這部分的接口內(nèi)的200納米的距離），其結(jié)果是一個非常低的電平的背景。

也可以通過落射照明的變形進行全內(nèi)反射熒光顯微鏡接近利用寬視場技術(shù)（圖7（b）中示出）。此方法需要一個非常高的數(shù)值孔徑的物鏡（至少為1.4，但優(yōu)選為1.45?1.6）和從一個側(cè)面部分的顯微鏡視場照明由一個小的運動或由薄環(huán)的更均勻的照明。高折射率透鏡的液浸介質(zhì)和顯微鏡蓋玻璃需要實現(xiàn)全內(nèi)反射造成的照明角度。圖7（b），退出物鏡前透鏡元件的光的角度小于臨界角（記為A（1） ）在圖7的（b））中提出的傳輸相差顯微鏡。當增加或超過臨界角的角度（表示角度A（2）在圖7（b）），全內(nèi)反射的結(jié)果。

其他流行的先進的熒光技術(shù)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和熒光漂白后恢復(fù)（FRAP），以及光譜，往往是結(jié)合與內(nèi)部全反射來實現(xiàn)額外的信息。其結(jié)果是一個非常強大的工具，研究個別熒光基團和熒光標記分子。從研究單個分子的性質(zhì)所產(chǎn)生的優(yōu)勢才剛剛開始被贊賞。因此，現(xiàn)在光學顯微鏡的電流范圍從單分子延伸到整個動物。

結(jié)論

現(xiàn)代熒光顯微鏡結(jié)合的高性能光學元件與電源計算機控制儀器和數(shù)字圖像采集到實現(xiàn)的復(fù)雜程度遠遠超過簡單的觀察到人的眼睛。電子成像顯微鏡現(xiàn)在在很大程度上取決于在低光照水平或在視覺檢測不到的波長快速獲取信息。這些技術(shù)上的改進不是單純的門面，但是光鏡下作為一個系統(tǒng)的重要組成部分。

光學顯微鏡時，純粹是描述性的工具或智力玩具的時代已經(jīng)過去。目前，光圖像形成的是數(shù)據(jù)分析的第一步。在顯微鏡來完成結(jié)合的電子檢測器，圖像處理器和顯示設(shè)備的成像系統(tǒng)的擴展，可以被看作是這第一步。電腦控制的焦點，舞臺上的地位，光學元件，百葉窗，過濾器，和探測器是在廣泛使用和使力所能及的機械顯微鏡實驗操作。在熒光顯微鏡中的電子光學系統(tǒng)的應(yīng)用越來越普遍，導(dǎo)致能夠操縱亞細胞結(jié)構(gòu)或顆粒，單分子成像，和復(fù)雜的光譜應(yīng)用廣泛的光鑷的發(fā)展。