徠卡顯微鏡：相襯-使未染色相對象可見

相襯是使未染色的相位對象（例如，扁平細胞）在光學(xué)顯微鏡下可見的光學(xué)對比度的技術(shù)。出現(xiàn)在明不起眼的和透明的細胞可以被視為在高對比度和豐富的細節(jié)相襯顯微鏡。

使用圖像形成的相移

相對象引起的相移的標(biāo)本的光通過。因為只有振幅位移（強度差異）對于人眼或光電檢測器是可見的，染色的標(biāo)本介導(dǎo)的振幅移位和通過的光的強度的差異。許多染色試劑的活細胞是有毒的，但是。相襯顯微鏡提供了一個可以使用的光程長度的差異所造成的相移的標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下可見。它通過干擾導(dǎo)致光波的振幅變化的相移變化。

在1930年由荷蘭物理學(xué)家弗里茨澤尼克相襯顯微鏡技術(shù)開發(fā)。澤尼克技術(shù)在1942年投入使用后，于1953年被授予諾貝爾物理學(xué)獎。

圖 1A：MDCK細胞，相襯顯微鏡

圖 1B：MDCK細胞，明亮的視野顯微鏡

圖 1C：阿米巴變形蟲，相襯顯微鏡

圖 1D：阿米巴變形蟲，明亮的視野顯微鏡

光波的干擾

的光路長度的光路中的兩個點之間的折射率和厚度的商品。這是相關(guān)的渡越時間和光速。中的差異導(dǎo)致的光的波以不同的速度的光路長度時，通過試樣（即相移）。其結(jié)果的相位差發(fā)生。較高的折射率比周圍介質(zhì)的光波，其相位的相位差導(dǎo)致的減速。

干擾介紹了兩波與對方的互動，形成一個新的波浪圖案疊加原理。相關(guān)參數(shù)的干擾光波，光波的振幅。如果兩個波干擾，產(chǎn)生的光波的振幅等于兩個干擾波的振幅的矢量和。

如果所產(chǎn)生的波的振幅增加時，建設(shè)性的干擾將被描述為。這將是要么兩個波峰或兩個波谷的情況下，如果在同一個時間點見面。一個波的波峰和波谷又一撥也有可能是在同一個時間點見面。這將導(dǎo)致降低所產(chǎn)生的波的振幅。然后，這兩個波之間的干擾被稱為破壞性的。

用相襯顯微鏡的光路中

相襯顯微鏡的關(guān)鍵要素是環(huán)光圈和相位板。環(huán)空孔被放置在冷凝器的前焦平面限制貫通光波的角度。的相位板位于物鏡的后焦面和具有相位環(huán)的材料制成的，通過它的光變暗，并且改變其相位通過λ/ 4。λ為光的波長。

在相差顯微鏡科勒照明的條件下，這是不與試樣相互作用的光波集中在物鏡的后焦面，為亮環(huán)?？臻g的光環(huán)環(huán)沿著光軸相匹配，并導(dǎo)致不偏離的光的相移。光的衍射的試樣不主要取得的相位環(huán)，因此，不會受到影響。

受影響和不受影響的光波之間的是一個總的為λ/ 2的相移。不偏離的光的相位是先進的λ/ 4的相位環(huán)，衍射光的波通常是λ/ 4的延遲的生物樣本。λ/ 2的總的相移可以在圖像平面上的光的波的破壞性干擾。暗淡的不偏離的光通過相位環(huán)，重要的是要避免的不偏離的偏離光相比一枝獨秀。

λ/ 2的相移，在相襯顯微鏡觀察，波峰和波谷有效地滿足在同一時間點上產(chǎn)生了一個極大的破壞性干擾效應(yīng)。因此光的波的振幅減小，被變換成幅移相對象的相移。

圖 2：在相襯顯微鏡的光學(xué)路徑。的環(huán)形形狀的光聚焦在試樣上通過冷凝器，通過冷凝器的環(huán)形帶。部的環(huán)狀的光衍射結(jié)構(gòu)的試樣（例如質(zhì)膜，細胞器等），光密經(jīng)歷了相移約?λ（通常為生物試樣）。此相移，并繞過衍射光的相位環(huán)，和由相位環(huán)（大多分布在物鏡的后焦平面）幾乎沒有影響。與此相反，直接來自冷凝器的環(huán)形帶的環(huán)形光擊中的相位環(huán)，這將暗淡的直射光引起的相移（通常是先進的?λ或滯后?λ為正相襯）。作為折射的光之間的總相移的標(biāo)本的光通過相位環(huán)?λ，破壞性的干擾就會發(fā)生。光密的結(jié)構(gòu)也將隨之出現(xiàn)深（正相襯）。

圖 3：相環(huán)相襯顯微鏡的核心組成部分。一般它是由一個灰色的過濾器和一個保持板。沒有出現(xiàn)衍射，通過試樣的一部分光通過相位環(huán)（左箭頭）?；疑臑V光變暗以避免光照射。保持板的非衍射的光的相位延遲允許干擾的光波，經(jīng)驗豐富的相移和衍射，通過檢體（右箭頭）。

正面和負面的 - 兩種形式的相襯

有兩種形式相襯：正面和負面的相襯。它們的主要區(qū)別在于由相位差板的照明使用。正相襯，光通過相位環(huán)的相位前進相比，偏離光，而被延遲的相位在負相襯。在負相襯的相位的相位差導(dǎo)致到破壞的相位差。光波相和的，建設(shè)性的而不是破壞性的干擾發(fā)生干擾。這將導(dǎo)致產(chǎn)生的光的波的振幅的增加。  

正相襯顯微鏡，具有較高的折射率比周圍介質(zhì)中的對象比折射率低的對象的顯示的顏色較深。對于負相襯相反。

解讀相襯圖像

相襯顯微鏡可視化的標(biāo)本的光路長度的差異。的光路長度與試樣的厚度和折射率。蜂窩結(jié)構(gòu)，如細胞膜和細胞器的光學(xué)路徑長度產(chǎn)生深遠的影響。由于許多細胞（尤其是在細胞培養(yǎng)）有平面和定期的形狀，它們是很難在明顯微鏡可見。

甲這種細胞相襯圖像放大細胞結(jié)構(gòu)的差異，可以看作是光密度圖，作為光密度值的標(biāo)本或材料的折射率有很大的影響。然而，一些效果復(fù)雜的相襯圖像的正確解釋，因為他們不直接依賴于不同的光程長度。

光環(huán)效應(yīng)描述的外觀，明亮的邊緣正相襯或負相襯大型物體周圍黑暗的邊緣。暈圈的形成，因為從檢體穿過的相位環(huán)，以及衍射光。在不偏離的波所形成的光的環(huán)比的相位環(huán)和低空間頻率衍射光波從檢體，可以通過該環(huán)形帶的小一點點。偏離的光通過相位環(huán)保持90°的相位差，因此不會受到破壞性干擾。這導(dǎo)致了逆轉(zhuǎn)相反的邊界處的大對象導(dǎo)致的暈。

關(guān)閉遮陽效果描述與周圍介質(zhì)相同的光照強度均勻的部位的標(biāo)本顯示的情況下。雖然這些區(qū)域的光通過經(jīng)歷的相移時，只有輕微的衍射和散射角大大降低。因此，這些光波進入相環(huán)，如不偏離的光線并沒有受到干擾。

相襯顯微鏡中的另一個問題是對比度反轉(zhuǎn)。如果存在具有非常高的折射率與低折射率的對象的對象，它們會顯得更亮，而不是更暗（正相位對比）。在這樣的區(qū)域中的相移是不是通常的λ/ 4移位的生物樣本，而不是相消干涉，發(fā)生相長干涉（相反為負相襯）。

雖然這些效果可以使相襯圖像難以解釋，相襯顯微鏡是一種方便和重要的光學(xué)對比度成像技術(shù)相對象。此外，相襯顯微鏡使細胞功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)查活標(biāo)本，成為最常生物學(xué)研究中的應(yīng)用對比法。

圖 4A：黑，相襯顯微鏡

圖 4B：大鼠睪丸，相襯顯微鏡

圖 4C：菜豆，相襯顯微鏡