尼康顯微鏡：水浸物鏡的結(jié)構(gòu)

薄切固定的組織切片和活細(xì)胞附著到玻璃基板上的微觀調(diào)查，定期制作精湛的高清晰度圖像時(shí)，用人的計(jì)劃復(fù)消色差透鏡或螢石物鏡的具有高數(shù)值孔徑。然而，目前的生物研究的顯著量的涉及到生物體組織內(nèi)，其中重要的事件可能會(huì)發(fā)生內(nèi)的檢體的深部，遠(yuǎn)離玻璃蓋的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)調(diào)查。嘗試細(xì)胞的細(xì)節(jié)圖像，并與傳統(tǒng)的油浸技術(shù)從標(biāo)本玻璃蓋千分尺距離活動(dòng)經(jīng)常遭受的文物，包括嚴(yán)重的光學(xué)像差（球形）。作為液浸介質(zhì)中，使用水代替油，是一種有效的方法來克服的像差問題，涉及活細(xì)胞和組織的應(yīng)用，高度校正后的水浸物鏡已經(jīng)由幾家制造商引入。

最近的技術(shù)進(jìn)步，加上新的熒光探針的發(fā)展，儀器儀表和軟件系統(tǒng)相結(jié)合，顯著推進(jìn)在活細(xì)胞和組織研究的前沿知識(shí)。的主要光學(xué)和定量的成像技術(shù)，利用這些調(diào)查包括共聚焦和多光子顯微鏡，微分干涉相差（DIC），和傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)落射熒光方法。在活細(xì)胞研究的一個(gè)基本問題是需要的細(xì)胞被包圍在一個(gè)適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)生理溶液的腔室或容器，以及區(qū)域或感興趣的事件通常位于50至200微米以上，遠(yuǎn)離玻璃蓋，妥善保養(yǎng)。一些研究者已經(jīng)討論了采用高數(shù)值孔徑的油浸物鏡成像焦平面，還不能立即相鄰的玻璃蓋的局限性。確定的最嚴(yán)重的缺陷是降低分辨率和圖像強(qiáng)度，并，這些工件成為顯著的距離超過約15微米的玻璃蓋。折射率的光路中的不匹配所造成的球面像差的圖像質(zhì)量惡化的首要原因，這個(gè)像差的增加成正比的成像深度。

利用浸沒流體的主要理性實(shí)現(xiàn)的物鏡的最大數(shù)值孔徑，提供改進(jìn)的衍射限制的空間分辨率。然而，比較實(shí)用的優(yōu)點(diǎn)是，不太可能發(fā)生的球面像差。由于典型的顯微鏡物鏡的光學(xué)玻璃的折射率，最高目前由油浸物鏡最終光學(xué)性能。在理想的成像條件下，最佳的光學(xué)性能是通過使用浸油物鏡前透鏡元件和玻璃蓋的折射率完全匹配。換人水或其它液浸介質(zhì)具有較高或較低的折射率，這會(huì)降低性能。然而，在情況下，是不理想的，其中球面像差成為圖像質(zhì)量的限制因素，較低折射率的浸沒液體的使用常常是有利的。介紹含水介質(zhì)中的成油狀物浸沒系統(tǒng)的光路的增加的球面像差，以及實(shí)現(xiàn)采用水浸物鏡的結(jié)果，簡(jiǎn)單地從當(dāng)時(shí)的成像條件下的最重要的和限制的像差減少的好處。

光思考理論

在活細(xì)胞和組織的研究應(yīng)用最廣泛的方法之一，是傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光顯微鏡，在高數(shù)值孔徑的油浸物鏡緊鄰玻璃蓋的相對(duì)平坦的試樣用于觀察。固定的組織切片或細(xì)胞被嵌入在水性介質(zhì)中具有不同的（低級(jí)）的折射率比玻璃蓋。折射后出射的光的客觀穿過浸油和蓋玻璃（由設(shè)計(jì)具有相同的折射率），并遇到接口與包埋劑，具有不同的折射率。上面的折射率界面的光偏差的凈效應(yīng)取決于觀察面的深度。在焦平面附近的玻璃蓋，在物鏡光學(xué)設(shè)計(jì)要求被滿足時(shí)，系統(tǒng)的性能相當(dāng)不錯(cuò)。

如共聚焦和多光子顯微鏡技術(shù)的引進(jìn)和開發(fā)，改變了成像的要求從傳統(tǒng)的情況下，通過使研究更厚的標(biāo)本，大標(biāo)本量的三維可視化，往往涉及某種形式的圖像卷積或重建。的圖像的光學(xué)部分在遠(yuǎn)離玻璃蓋接觸，試樣，大深度的能力，在該系統(tǒng)的光學(xué)特性的改變的光穿過的培養(yǎng)基中這是不希望的設(shè)計(jì)。光學(xué)矯正是優(yōu)化的光分布在均勻介質(zhì)中相鄰的玻璃蓋，盡管在實(shí)踐中，觀察量可能相差一定距離，和由折射率差的焦點(diǎn)的距離的光的分布顯著影響從玻璃平面。所產(chǎn)生的偏差造成損失的分辨率和信號(hào)強(qiáng)度，以及重點(diǎn)轉(zhuǎn)移。指出在20世紀(jì)80年代中期，在分辨率和圖像亮度降低，發(fā)生在許多情況下，當(dāng)飛機(jī)從觀察到更深的區(qū)域在試樣試樣玻璃界面，由Stefan W.地獄和其他，并成為主題大量的研究，旨在在共聚焦熒光圖像的解釋。

如圖2中所示的油浸物鏡功能的理想情況下（圖2（a）），比較光的情況下的折射率之間的不匹配的浸油和水性介質(zhì)嚴(yán)重的圖像畸變的結(jié)果（圖2（b ））。成像由含水介質(zhì)中的區(qū)域是分開的玻璃蓋的試樣平面代表為準(zhǔn)厚的生物試樣研究的光學(xué)條件，所遇到的圖像劣化是一個(gè)主要的水浸物鏡的就業(yè)激勵(lì)。

復(fù)消色差透鏡的俯視油浸物鏡的就業(yè)情況建立了理想的光學(xué)當(dāng)試樣是在直接接觸玻璃蓋，以確保均勻的折射率（名義上為1.515），在試樣表面的整個(gè)光路從焦點(diǎn)通過蓋玻璃，進(jìn)入浸油，并繼續(xù)到前面的物鏡元素。在此配置中（圖圖2（a）），無折射光波發(fā)生的物鏡的數(shù)值孔徑，是利用。此外，鏡頭畸變控制，所產(chǎn)生的圖像表現(xiàn)出最大的分辨率和對(duì)比度。

由于焦平面調(diào)整向更深的區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞或組織的部分，或者如果位于下方的層的生理介質(zhì)中，光路穿過折射率接口或梯度之間的試樣組（n = 1.35），生理食鹽水溶液試樣溶液組（n = 1.33），和蓋玻璃浸油物鏡的組合組（n = 1.515）。于各折射率界面，其結(jié)果發(fā)生的折射光線的物鏡的數(shù)值孔徑，沒有意識(shí)到，作為物鏡偏離其設(shè)計(jì)準(zhǔn)則，介紹了光學(xué)像差。向著光軸折射引起的光線彎曲，因?yàn)樗麄兺ㄟ^從含水介質(zhì)中的折射率高的玻璃，有效地限制了的物鏡的最大數(shù)值孔徑（參見圖2（b）條）。水引入的光路中的浸油系統(tǒng)，利用一個(gè)1.4數(shù)值孔徑的物鏡，例如，降低的有效數(shù)值孔徑為1.33到最大值。通過一層水或生理介質(zhì)中觀察試樣時(shí)，油浸物鏡不能滿足其設(shè)計(jì)性能，并導(dǎo)致嚴(yán)重的不利影響，在圖像中引入的球面像差。這些效果在試樣的深度成比例增加的焦點(diǎn)的距離變得更遠(yuǎn)的玻璃蓋的下表面上。

在涉及的攝像的活細(xì)胞，利用浸油的研究中，球面像差變成圖像質(zhì)量的一個(gè)限制因素。按比例增加的細(xì)胞物質(zhì)或周圍的細(xì)胞的含水介質(zhì)中的像差成像深度表現(xiàn)為減弱的強(qiáng)度和對(duì)比度，防止較小的試件的詳細(xì)信息的分辨率。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，這種失真的影響足以引起誤解的檢體的結(jié)構(gòu)，如海洋生物中的纖毛。反褶積方法中的應(yīng)用數(shù)學(xué)補(bǔ)償?shù)氖д娴倪@種性質(zhì)是一個(gè)可能的解決方案，雖然精確的測(cè)量的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）是必要的，并且實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)成為問題的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)時(shí)，被扭曲的軸向和橫向。

在所有三維顯微鏡，它被越來越多地應(yīng)用于活細(xì)胞和其他非嵌入的生物標(biāo)本，在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的像差的調(diào)查方法，是顯著的，因?yàn)橄鄬?duì)低折射率的標(biāo)本。點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的扭曲誘導(dǎo)的球面像差，在共聚焦顯微鏡中的特別重要的意義，因?yàn)榭梢杂袚p害的能力，共聚焦顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)：消除外的焦點(diǎn)信息，以提高對(duì)比度和有效的xy平面中的分辨率，以及創(chuàng)建高分辨率XYZ光學(xué)部分。折射率不匹配的圖像畸變的原因是在一定程度上，水浸的就業(yè)物鏡應(yīng)該大大增強(qiáng)高分辨率深度依賴低折射率成像的標(biāo)本。

在一個(gè)三維的試樣的顯微鏡，圖像數(shù)據(jù)可被認(rèn)為包含畸變的試樣的表示形式，或已經(jīng)模糊了，由三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。如果反褶積方法將被利用來重建對(duì)象的異常的圖像數(shù)據(jù)，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的精確量是必需的。無論是直接測(cè)量和計(jì)算方法來描述點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，每種技術(shù)都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。當(dāng)實(shí)驗(yàn)對(duì)比油狀物浸沒系統(tǒng)和水浸獲得的數(shù)據(jù)，通過測(cè)量或計(jì)算的三維點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，焦平面依賴球面像差顯著地降低在水中浸沒系統(tǒng)。

和浸入物鏡試樣（油和水）之間發(fā)生的成像光線追跡的比較在圖3中，隨著幾何模型的熒光珠在含水介質(zhì)中的接口100微米以下的xz圖像的預(yù)測(cè)。在圖3（a）圖中，在左邊的球體表示的熒光珠的實(shí)際形狀，而在右側(cè)的細(xì)長(zhǎng)形狀是提供的油浸物鏡成像的印象。光線追跡到油浸物鏡前面的鏡頭（圖3（b））和水浸的目的（圖3（c））珠（圖3中的黃色箭頭）的折射率不匹配如何掩蓋實(shí)際試樣透露細(xì)節(jié)的幾何形狀。在水介質(zhì)中，在胎圈到一個(gè)明顯的細(xì)長(zhǎng)橢圓形失真油浸物鏡成像時(shí)，如在圖3（b）中示出，但仍使用水浸物鏡（圖3（c））時(shí)，球形。一個(gè)藍(lán)色的球體表示的實(shí)際試樣的表觀圖像被表示為一個(gè)紅色的橢圓形或紅球。

在用于三維圖像數(shù)據(jù)的順序是一個(gè)可靠的真實(shí)樣品的代表性的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)卷積，它必須是已知的，不隨軸向或橫向的焦點(diǎn)位移的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)。在實(shí)踐中，這可能不是設(shè)計(jì)的物鏡是，如果條件沒有得到滿足的情況下。的物鏡的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)試樣中，浸沒介質(zhì)，和玻璃蓋的厚度和折射率的折射率的函數(shù)。當(dāng)試樣液浸介質(zhì)匹配的折射率，像差被最小化的任何試樣的厚度，因?yàn)榫劢乖谠嚇又械母畹钠矫娼橘|(zhì)結(jié)合在該介質(zhì)中的光路長(zhǎng)度增加補(bǔ)償減少的液浸介質(zhì)中的路徑長(zhǎng)度。兩個(gè)階段位移的影響可互相抵消，從而使透鏡系統(tǒng)的目的和圖像共軛的表面重合，如所需的圖像形成無像差。油浸物鏡，因此，利用圖像包埋標(biāo)本，但表現(xiàn)出顯著的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的圖像低指數(shù)生物標(biāo)本時(shí)沿光軸偏差達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。在一個(gè)系統(tǒng)中，其中沿軸向變化的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)將計(jì)算為每個(gè)圖像平面中的三維堆疊，需要一個(gè)復(fù)雜的模型，用于計(jì)算的方差，以及一個(gè)圖像處理算法的強(qiáng)大的比卷積。這些因素提供了強(qiáng)有力的理由調(diào)查三維生物標(biāo)本，利用水浸的物鏡在努力，以盡量減少軸向點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的方差，以及由此產(chǎn)生的圖像畸變。

水浸入式光學(xué)設(shè)計(jì)和性能

任何浸泡的目的，需要前鏡頭元件和試樣之間的空氣以外的流體的基本功能之一是為了增加系統(tǒng)的數(shù)值孔徑。在利用油浸物鏡，它最初出現(xiàn)。將玻璃蓋的厚度并不重要，因?yàn)樗恼凵渎蚀笾缕ヅ涞慕]流體。這實(shí)質(zhì)上是真實(shí)的，只要試樣安裝在加拿大香脂或其他類似的折射率的介質(zhì)的玻璃蓋。當(dāng)試樣安裝在水性介質(zhì)中，如生理鹽水中，具有顯著不同的玻璃和浸油的折射率，光學(xué)性能的變化相當(dāng)大。因此，聚焦通過什至10微米厚的水層可以引入嚴(yán)重的圖像畸變，由于非對(duì)稱，相對(duì)于焦平面的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)（參見圖2和圖3）。樣本，除非在觀察區(qū)域中直接接觸玻璃蓋，利用修正油浸物鏡的透鏡像差的光學(xué)假設(shè)是無效的。

由于油浸物鏡的這種行為變得更加明顯調(diào)查，被確認(rèn)和三維成像研究活細(xì)胞和組織上的新興技術(shù)的限制，一些顯微鏡制造商開始引入校正高數(shù)值孔徑的水浸在20世紀(jì)90年代中期的物鏡。計(jì)劃復(fù)消色差校正，數(shù)值孔徑約1.2，水浸物鏡稍低的數(shù)值孔徑值可比的油浸鏡頭，但添加允許200微米的順序通過水層的高分辨率成像的關(guān)鍵能力的厚度。雖然水浸的物鏡的主要優(yōu)點(diǎn)是改善了成像功能在低折射率的生物標(biāo)本的厚制劑，以及其他的實(shí)際利益是來自于使用水作為浸沒流體。水沒有固有的熒光復(fù)雜圖像解釋，很少有污染的生理溶液的風(fēng)險(xiǎn)，水溶液中不要求特殊的清理方法，成本可忽略不計(jì)。

考慮井上伸也首次提出規(guī)范發(fā)展，高度糾正60X計(jì)劃復(fù)消色差透鏡水浸的目的所產(chǎn)生的尼康代表由其他制造商推出類似的物鏡。的物鏡具有1.2的數(shù)值孔徑和工作距離為220微米，得到在該深度處的潛在圖像的焦平面內(nèi)的水傳播的試樣（見圖1）。的校正環(huán)可以調(diào)整，以適應(yīng)護(hù)罩玻璃的厚度從0.15毫米至0.18毫米，消除球面像差的一個(gè)基本特征。此外，該物鏡從近紫外到紅色的可見光光譜區(qū)域具有高傳輸和色差校正，因此，可以利用共聚焦顯微鏡和常規(guī)熒光和微分干涉相差（DIC）技術(shù)。

正如前面所討論的，均勻的浸泡將確保光線偏轉(zhuǎn)，直到達(dá)到物鏡的第一透鏡元件的后表面上，通過試樣浸沒介質(zhì)的道路上。如果折射率接口被消除，物鏡可被設(shè)計(jì)成在其整個(gè)聚焦范圍達(dá)到衍射極限性能。低折射率的樣品的水浸中的應(yīng)用的更高折射率的浸沒油消除了該問題，但如果水浸的目的是用來用護(hù)罩玻璃，玻璃和水的折射率之間的差被引入（圖2（ c）條）。確切的折射率和厚度的玻璃蓋在實(shí)現(xiàn)最大分辨率變得至關(guān)重要，是許多水浸物鏡的原因，包括不同的護(hù)罩玻璃性能的補(bǔ)償校正衣領(lǐng)。光學(xué)塑料也可能是有用的減少安裝介質(zhì)和水物鏡的浸沒流體的折射率之間的不匹配。塑料蓋“眼鏡”，具有折射率在1.35和1.4之間的范圍內(nèi)顯著降低，遍歷從檢體通過水性介質(zhì)中的物鏡前透鏡元件的成像光線的折射角。

水浸的物鏡已經(jīng)實(shí)用評(píng)測(cè)由許多研究者進(jìn)行的，利用不同的方法來評(píng)估在某些應(yīng)用中，這種類型的系統(tǒng)的好處。基于理論考慮的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的球面像差的影響，清晰等優(yōu)點(diǎn)水浸過油浸技術(shù)，生物研究的預(yù)測(cè)，尤其是樣品平面玻璃蓋一定距離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在很大程度上支持了理論預(yù)測(cè)，展示形象深入到水標(biāo)本的能力，顯著改善，結(jié)果與油浸物鏡相比。

一個(gè)實(shí)驗(yàn)評(píng)估，在一個(gè)60X（1.4數(shù)值孔徑）計(jì)劃復(fù)消色差透鏡油浸物鏡相比，進(jìn)行了60倍的水浸計(jì)劃復(fù)消色差透鏡物鏡1.2數(shù)值孔徑，如上所述的性能成像測(cè)試物鏡和高度詳細(xì)硅藻在低于玻璃蓋的各種距離（參見圖4）。與理論預(yù)測(cè)的結(jié)果是一致的：生產(chǎn)油浸物鏡只有當(dāng)試樣直接接觸玻璃蓋均位于具有出色的分辨率和高對(duì)比度的圖像，表現(xiàn)出嚴(yán)重的對(duì)比度下降時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)均通過84微米成像水層。水浸物鏡生產(chǎn)油浸物鏡，相比稍低的分辨率和對(duì)比度，當(dāng)物鏡標(biāo)本與玻璃蓋接觸，但圖像質(zhì)量保持層中加入水時(shí)，基本上沒有降解的成像路徑。

圖4展示的是與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的60倍復(fù)消色差透鏡1.4數(shù)值孔徑的油浸物鏡（圖4（a）和圖4（b））的結(jié)果相比，用一個(gè)60倍復(fù)消色差透鏡1.2數(shù)值孔徑的水浸的目的成像的星形測(cè)試物鏡的中央部（圖4（c）和4（D））。將試樣制備（圖4（b）和圖4（d））與水或不帶水（圖4（a）和圖4（c））之間的玻璃蓋（170微米厚），測(cè)試物鏡。在圖4（a）中，物鏡圖像被捕獲的油浸物鏡和測(cè)試物鏡和護(hù)罩玻璃之間沒有水。的對(duì)比度上面的半徑為2.3微米，這對(duì)應(yīng)于約0.2微米間距從中心消失。黑盤的中央有一個(gè)直徑為1.2微米，以提供一個(gè)尺寸參考。當(dāng)利用相同的物鏡圖像的物鏡與84微米之間的水的測(cè)試物鏡和玻璃蓋，對(duì)比度嚴(yán)重退化，低于0.4微米的間距變得不可見（圖4（b））。相比較而言，當(dāng)測(cè)試物鏡與物鏡之間的蓋玻璃的水沒有水浸物鏡成像，對(duì)比度低于0.24微米的間距（圖圖4（c））中消失。當(dāng)與物鏡之間的玻璃蓋（類似于上面所討論的油浸物鏡），一個(gè)84微米的層的水被放置對(duì)比度仍然很高（圖圖4（d）），水浸物鏡的性能不會(huì)受到損害由玻璃蓋和測(cè)試物鏡之間的額外的水層。

示出的兩個(gè)物鏡的性能的定量評(píng)價(jià)圖形的對(duì)比度傳遞函數(shù)的測(cè)試物鏡組成的等距隔開的各空間頻率（圖5）的光與暗的酒吧。的對(duì)比度傳輸曲線圖所示的光學(xué)系統(tǒng)是能夠從物鏡（試樣）傳輸?shù)綀D像物鏡對(duì)比度的量（以百分比表示）。對(duì)于一個(gè)給定的空間頻率的物鏡保持充分的對(duì)比度的圖像，將在圖形上繪制為100％，較完善的對(duì)比度傳遞由系統(tǒng)。由于對(duì)比度下降在較高的空間頻率，它最終會(huì)被減小到零，它可以被視為被評(píng)價(jià)的光學(xué)系統(tǒng)的分辨率的絕對(duì)限制在一個(gè)特定的行間距。每個(gè)圖形顯示在以下幾種情況下產(chǎn)生的對(duì)比傳遞函數(shù)：沒有水層之間的玻璃蓋和測(cè)試光柵，并添加不同的水層厚度。此外，理論上計(jì)算出的對(duì)比度傳遞函數(shù)繪制相應(yīng)的數(shù)值孔徑為無像差的物鏡。數(shù)據(jù)高達(dá)153微米的水被水浸的目的，而50微米的最大水厚度油浸物鏡所示。

正如圖5中所示，水浸的目的提供了對(duì)比度和分辨率的值幾乎相當(dāng)于理論極限，80和153微米的水層中加入物鏡試樣和蓋玻片之間，并保持其性能，仿真中遇到的情況深于水的材料，例如活細(xì)胞或組織成像。與此相反，油浸物鏡表現(xiàn)出分辨率的限制減少了50％，嚴(yán)重退化的對(duì)比度進(jìn)行測(cè)試時(shí)，只有50微米的水覆蓋的物鏡。的性能急劇下降，隨著空間頻率的增加。

額外的評(píng)估已經(jīng)證明的能力高數(shù)值孔徑計(jì)劃復(fù)消色差水浸物鏡，獲得高質(zhì)量的圖像深度為220微米的水，一個(gè)壯舉，就根本不可能使用油浸物鏡。執(zhí)行其他調(diào)查測(cè)量的水浸物鏡的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，它支持的測(cè)試物鏡的性能報(bào)告，并進(jìn)一步說明焦點(diǎn)平面的上方和下方的功能改進(jìn)的對(duì)稱性的好處。的測(cè)量結(jié)果表明，隨深度變化的失真可以建模和校正，使透鏡可用于精確測(cè)量沿?軸垂直分辨率測(cè)定。的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的客觀事實(shí)，即上方和下方的焦平面（表示最小的球面像差）是對(duì)稱的，使得它可以為目的，其數(shù)值孔徑的理論計(jì)算的軸向分辨率相匹配。該光學(xué)性能的一個(gè)有利于整體施加到三維的試樣相比，以相同的技術(shù)，利用油浸物鏡在圖像去卷積方法中是一個(gè)顯著的改善。此外，基本消除水浸物鏡的球面像差在改進(jìn)的信號(hào)收集和圖像的亮度時(shí)，在水深超過約20微米的在水介質(zhì)中或組織的成像。

共聚焦顯微鏡的特殊方面

聚焦方法的主要好處包括控制焦平面厚度的限制，允許光學(xué)切片和改進(jìn)消除耀斑圖像平面外所產(chǎn)生的信號(hào)的分辨率和對(duì)比度。這兩個(gè)因素綜合起來，以允許提供的三維表示厚標(biāo)本的XZ掃描圖像。球面像差限制了這些功能，并在試樣時(shí)，試樣的折射率不同的浸沒流體的深度成比例增加。如果油浸物鏡用于與含水的試樣，添加約三分之一波的球面像差為每微米聚焦深度低于玻璃蓋。少量的球面像差引起的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的擴(kuò)展和等效軸向分辨率的損失（見圖6）。累積超出約10微米，如果聚焦到一個(gè)低折射率的標(biāo)本的很大程度的像差產(chǎn)生相當(dāng)大的模糊的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和圖像中的對(duì)比度的損失。如果不消除球面像差，清晰度和對(duì)比度損失聚焦的方法覆蓋任何利益成像時(shí)，在水深超過約15微米的玻璃蓋。利用水浸物鏡消除這些問題提供了實(shí)實(shí)在在的好處，如活細(xì)胞成像時(shí)，水標(biāo)本。

折射率不匹配產(chǎn)生的球面像差，尺寸測(cè)量形態(tài)的誤解和錯(cuò)誤的程度，可以發(fā)生扭曲光學(xué)數(shù)據(jù)。眾所周知的三維顯微鏡標(biāo)本的失真表現(xiàn)為沿著光軸（z -軸）的伸長(zhǎng)率功能。多項(xiàng)技術(shù)來衡量和計(jì)算模擬的效果，但超過的幅度和確切原因存在矛盾。的工件已實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是，已知會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致它的目的似乎是它的實(shí)際大小的3倍（圖3）的軸向伸長(zhǎng)。異常取決于浸沒條件下，被認(rèn)為是一個(gè)事實(shí)，即不會(huì)導(dǎo)致直接對(duì)應(yīng)的焦點(diǎn)位置的位移的軸向階段的活動(dòng)所造成的。估計(jì)距離和體積的錯(cuò)誤發(fā)生，在各種形式的三維定量顯微鏡具有重大影響。其中，已被證明在失真效果方面發(fā)揮作用的因素是嵌入或周圍的介質(zhì)中和浸沒流體，試樣尺寸，玻璃蓋之間的距離，和物鏡的數(shù)值孔徑的折射率之間的不匹配。利用水浸成像低折射率的標(biāo)本，如生物材料時(shí)，將減輕的效果，雖然在某些條件下，將不能完全消除。細(xì)胞物質(zhì)通常在約1.33和1.39之間的折射率變化，因此一些折射率的不匹配可能仍然存在，即使當(dāng)使用水作為液浸介質(zhì)。

除了尺寸縮放的折射率不匹配時(shí)發(fā)生的錯(cuò)誤，可以由相同的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的扭曲引起的信號(hào)強(qiáng)度的顯著影響。許多共聚焦系統(tǒng)的配置，掃描整個(gè)試樣的照明針孔利用在檢測(cè)路徑，被掃描的目的不包括所有來自檢測(cè)器的光聚焦在相同的機(jī)制。深內(nèi)的試樣，利用油浸物鏡成像時(shí)，球面像差的嚴(yán)重程度，可引起足夠的焦點(diǎn)偏移，大部分試樣中由熒光團(tuán)發(fā)射的光不能穿過針孔探測(cè)器。因此，大多數(shù)達(dá)到共焦檢測(cè)器所發(fā)射的信號(hào)從玻璃蓋除去試樣的區(qū)域之前丟失。伴隨著強(qiáng)度的損失，在所獲取的圖像的球面像差引起的焦點(diǎn)偏移，并繼續(xù)減少幾何距離成試樣。

發(fā)布的理論和實(shí)驗(yàn)分析確認(rèn)了1.3數(shù)值孔徑的油浸物鏡，成像深20微米的熒光平面內(nèi)的水介質(zhì)中，檢測(cè)峰強(qiáng)度低于40％，從飛機(jī)10 - 千分尺的深度。這個(gè)概念是在圖6中示出，其中顯示高數(shù)值孔徑的油浸物鏡，和其相應(yīng)的軸向響應(yīng)的共焦的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的等高線圖，在水中的一些成像深度。在圖6（a）的理想的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（無球面像差），而成像深度為5，10，15，和20微米到含水介質(zhì)中的圖中示出圖6（b）-6（五）元。通過應(yīng)用高數(shù)值孔徑的水浸的目的是減少或消除球面像差的有效途徑，以保持足夠的信號(hào)電平在高分辨率熒光顯微鏡。

一個(gè)經(jīng)常被忽視的優(yōu)點(diǎn)，使用共焦技術(shù)中的水浸物鏡是，水是粘滯性大大小于大多數(shù)浸沒油，因而在聚焦過程中，當(dāng)物鏡和試樣的制備相對(duì)位移施加較小的力（表面張力），在玻璃蓋給對(duì)方。玻璃蓋，因此，不太可能彎曲可能位移改變焦點(diǎn)時(shí)，在采集過程中的共焦的z系列試樣。在反復(fù)的重新調(diào)整，需要在光學(xué)切片標(biāo)本最小化運(yùn)動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致更清晰，更有意義的三維重建圖像的堆棧。

最近，水浸的物鏡已被實(shí)驗(yàn)證明是適用于多個(gè)物鏡的4Pi共聚焦顯微鏡和θ波顯微鏡技術(shù)如。的4Pi共焦顯微鏡中實(shí)現(xiàn)類似的軸向分辨率的近場(chǎng)光學(xué)技術(shù)，是通過從兩個(gè)相對(duì)的高孔徑物鏡相干聚焦的球形波陣面的組合。兩個(gè)球面波陣面的結(jié)果，在增加孔徑沿著光軸，和較窄的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的最小的相干疊加。這種技術(shù)產(chǎn)生了最高的三維日期，這是在100納米的結(jié)合圖像重建的順序得到的遠(yuǎn)場(chǎng)的分辨率。

高數(shù)值孔徑的水浸物鏡的發(fā)展之前，浸油的依賴有限4PI的共聚焦顯微鏡以甘油裝標(biāo)本。甘油（1.47）的折射率被充分地靠近浸油（1.51），因此，最小的軸向掃描過程中所需的相移補(bǔ)償。細(xì)胞研究的很大一部分涉及基于甘油的安裝媒體，和至少一個(gè)制造商已經(jīng)開發(fā)出了高數(shù)值孔徑的甘油浸泡的目的，以盡量減少從油甘油的折射率不匹配所導(dǎo)致的數(shù)據(jù)的降解。專為使用石英玻璃蓋（折射率1.46），鏡頭采用了一個(gè)的像差校正領(lǐng)容納甘油濃度在72％和88％之間。這一物鏡已被成功地應(yīng)用在三維熒光顯微鏡，應(yīng)該簡(jiǎn)化甘油裝標(biāo)本的4Pi顯微鏡。

到水或生理溶液中，然而，嚴(yán)重的球面象差和相移的情況下，在深度成像在不允許的4Pi顯微鏡浸油或甘油浸沒物鏡進(jìn)行。因此，油浸泡4PI方法并不適用于活細(xì)胞成像。高孔徑的水浸物鏡，以盡量減少球面像差引起的折射率不匹配扭曲傳統(tǒng)的共聚焦和多光子成像提供相同的優(yōu)點(diǎn)在4PI應(yīng)用于活細(xì)胞研究的方法。雖然水浸物鏡比可比油浸鏡頭具有較低的數(shù)值孔徑，一些研究已經(jīng)證明，他們產(chǎn)生有利的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的特性，它允許在三維成像的活標(biāo)本利用4PI顯微鏡軸向分辨率根本好轉(zhuǎn)。