奧林巴斯顯微鏡：熒光激發(fā)和發(fā)射基本面概述

由于其新穎的電子配置，熒光染料有獨(dú)特的特征吸收光譜（通常是類似的激發(fā)）和發(fā)射。這些吸收光譜和發(fā)射光譜表明相對(duì)強(qiáng)度的熒光，與經(jīng)典的相對(duì)強(qiáng)度與波長(zhǎng)在橫軸上繪制在垂直軸。對(duì)于一個(gè)給定的熒光染料，制造商指示的照明激發(fā)光強(qiáng)度和熒光的發(fā)光強(qiáng)度的峰值波長(zhǎng)為峰值波長(zhǎng)。重要的是要了解顯示對(duì)于一個(gè)給定的熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜的圖表和曲線的原點(diǎn)。

為了確定一個(gè)特定的熒光染料的最大吸收波長(zhǎng)（通常是相同的激發(fā)最大值）的發(fā)射光譜來(lái)確定，并在該波長(zhǎng)下被激發(fā)的熒光。一個(gè)典型的熒光染料的吸收光譜示出在圖1（a）如吸收的相對(duì)強(qiáng)度對(duì)測(cè)得的波長(zhǎng)作圖。甲單色儀（一種裝置，允許通過(guò)的窄頻帶的光的波長(zhǎng)），然后用于掃描的熒光發(fā)射強(qiáng)度，發(fā)射波長(zhǎng)在整個(gè)系列。熒光的相對(duì)強(qiáng)度的測(cè)量是在不同波長(zhǎng)繪制的發(fā)射光譜，圖1（b）中示出。以相似的方式確定一個(gè)給定的熒光染料的激發(fā)光譜的最大強(qiáng)度的波長(zhǎng)，而通過(guò)一組連續(xù)的波長(zhǎng)激發(fā)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射通過(guò)監(jiān)測(cè)。其最大發(fā)射選擇，唯一的排放物在該波長(zhǎng)的光傳遞給探測(cè)器。激發(fā)誘導(dǎo)（通常是通過(guò)單色儀），在不同的激發(fā)波長(zhǎng)所發(fā)射的熒光的強(qiáng)度作為波長(zhǎng)的函數(shù)的測(cè)量。其結(jié)果是一個(gè)圖形或曲線（圖1（a）中示出），示出在光譜的激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)所產(chǎn)生的相對(duì)熒光強(qiáng)度。

以下幾點(diǎn)結(jié)論：可以從一個(gè)典型的曲線或光譜的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射集。通常有較高的波長(zhǎng)的激發(fā)光譜和結(jié)束的下的發(fā)射光譜的波長(zhǎng)端之間的重疊。必須消除這種重疊激發(fā)和發(fā)射強(qiáng)度和波長(zhǎng)（圖1（c）中示出），在熒光顯微鏡中，激發(fā)光濾光片，二色光束分離器（在反射光中的熒光）的適當(dāng)選擇，通過(guò)阻擋或發(fā)射過(guò)濾。否則，激發(fā)光更亮淹沒(méi)弱熒光發(fā)射光，并大大減少了標(biāo)本的對(duì)比。

當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)到基態(tài)（見(jiàn)下面一節(jié)題為“ 分子解釋），有一個(gè)振動(dòng)能量損失。其結(jié)果是，被移動(dòng)到更長(zhǎng)的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜（波長(zhǎng)成反比的輻射能量）的發(fā)射光譜。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯“或斯托克斯位移。斯托克斯位移（Stokes shift）越大，越容易分開(kāi)激勵(lì)光從發(fā)射光。的發(fā)光強(qiáng)度的峰值通常是低于激發(fā)峰，發(fā)射曲線的往往是激發(fā)曲線的鏡像圖像，但轉(zhuǎn)移到更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。為了實(shí)現(xiàn)最大熒光強(qiáng)度，熒光染料通常是在該波長(zhǎng)激發(fā)激發(fā)曲線的峰值，選擇在發(fā)射曲線的峰值波長(zhǎng)（或觀察者所選擇的其它波長(zhǎng)的光）的發(fā)光檢測(cè)。的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇控制的適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器。在確定的光學(xué)系統(tǒng)的光譜響應(yīng)，技術(shù)修改需要考慮到對(duì)于不同波長(zhǎng)的玻璃傳輸和檢測(cè)器的靈敏度變量等因素。

在圖2中示出一個(gè)典型的熒光染料吸收的發(fā)光光譜圖。請(qǐng)注意，這個(gè)典型的熒光吸收（通常是相似的純化合物的激發(fā)曲線）和發(fā)射熒光強(qiáng)度的曲線形狀有幾分相似。一直被稱為十九世紀(jì)中期以來(lái)，（Stokes定律）之間的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)移位。另外請(qǐng)注意，激發(fā)和發(fā)射曲線的上端處的激發(fā)和發(fā)射曲線的較低的波長(zhǎng)有所重疊。

激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的分離是通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)倪^(guò)濾器，如在圖3中以阻止或通過(guò)特定波長(zhǎng)的光譜。熒光照明器的設(shè)計(jì)是基于容易地更換過(guò)濾器插入到光路的方式向試樣的激發(fā)光和發(fā)射光的控制，然后由試樣放出。中的發(fā)光強(qiáng)度低，這是很重要的，選擇的激發(fā)光源是足夠的亮度，因此，可以最大化的發(fā)光相對(duì)較弱的，令人滿意的吸收和生物產(chǎn)量，熒光染料的選擇。

被稱為消光系數(shù)的熒光染料吸收的激發(fā)光的效率的。消光系數(shù)越大，在一個(gè)給定的波長(zhǎng)區(qū)域（隨后的熒光發(fā)射的一個(gè)先決條件）的光吸收的可能性就越大。發(fā)射的光的產(chǎn)率被稱為量子數(shù)之比（“數(shù)據(jù)包”的能量）的量子產(chǎn)率，發(fā)射量子吸收（通常產(chǎn)率是0.1和0.9之間）的數(shù)量相比。低于1的量子產(chǎn)率是能量的損失通過(guò)非輻射途徑（如熱或光化學(xué)反應(yīng)），而不是重新輻射通路的熒光的結(jié)果。在表1下面列出的一組選定的熒光染料的熒光量子產(chǎn)率。請(qǐng)注意，一些量子產(chǎn)率似乎微不足道（苯），而別人是非常有效的（熒光素和羅丹明-B）。

熒光的熒光量子產(chǎn)率

表1

消光系數(shù)，量子產(chǎn)率，平均的光源的發(fā)光強(qiáng)度，熒光壽命的熒光發(fā)射的強(qiáng)度和實(shí)用程序的所有重要因素。此外，局部地區(qū)的環(huán)境周圍的熒光染料中起著極其重要的作用，在確定的熒光發(fā)射的特征。溶劑的粘度，離子濃度，pH值，和疏水性環(huán)境中的變量，如可以有深遠(yuǎn)的影響的熒光強(qiáng)度和激發(fā)態(tài)的壽命。

熒光分子解釋

圖解方式示于圖4（a）（稱為雅布隆斯基能量圖），有時(shí)被描述熒光活性。激發(fā)之前，被描述為在基態(tài)的分子的電子組態(tài)。吸收的激發(fā)光的光子，通常短的波長(zhǎng)時(shí)，電子可以被提高到一個(gè)更高的能量和振動(dòng)激發(fā)態(tài)，一個(gè)過(guò)程，可能只需要一千萬(wàn)億分之一的第二期間（時(shí)間段通常被稱為飛秒，10E 15秒）。

熒光，期間間隔約一萬(wàn)億第二（一皮秒或10E-12秒），被激發(fā)的電子可能會(huì)失去一些振動(dòng)能量對(duì)周圍環(huán)境和返回到了什么叫做最低激發(fā)單重態(tài)。從最低激發(fā)單重態(tài)的電子是“放松”返回到基態(tài)時(shí)，如在圖4中示出與同時(shí)發(fā)射的熒光光（一）。所發(fā)射的光總是比波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激發(fā)光（斯托克斯定律）和繼續(xù)，只要激發(fā)照明沐浴熒光試樣。如果被中止，令人興奮的輻射熒光停止。

有時(shí)候被激發(fā)的電子，而不是的放松的最低單重態(tài)，可通過(guò)振動(dòng)相互作用，使一個(gè)禁戒躍遷到退出的三重態(tài)，然后到基態(tài)的過(guò)程中，輻射的發(fā)射可能大大延遲幾秒鐘，或以上。這種現(xiàn)象是磷光特性，圖4（b）所示。在某些情況下，被激發(fā)的電子可以從三重態(tài)的最低激發(fā)單重態(tài)，然后返回到基態(tài)，隨后發(fā)出熒光。這個(gè)動(dòng)作需要較長(zhǎng)的時(shí)間比平常熒光（約一兩微秒），被稱為延遲熒光（圖4（c））。在其他情況下（例如，光漂白或鹽，重金屬或其他化學(xué)品的存在下），發(fā)出的光可能會(huì)被顯著減少或完全停止，如下文所述。

衰退或漂白

有一些特定的條件下可能影響再輻射的光激發(fā)熒光，從而降低熒光強(qiáng)度。這種減少的發(fā)光強(qiáng)度通常被稱為衰退或漂白。一些學(xué)者進(jìn)一步細(xì)分變?yōu)?/span>淬滅和漂白。漂白的熒光分子，因?yàn)樵诜肿友醮嬖谙碌墓鈴?qiáng)度是不可逆的分解。淬滅也導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的減少和經(jīng)常作為氧化劑或重金屬或鹵素化合物的鹽的存在下的結(jié)果帶來(lái)的。

通常情況下，淬滅結(jié)果的能量轉(zhuǎn)移到其他受體分子物理激發(fā)熒光基團(tuán)，這種現(xiàn)象被稱為共振能量轉(zhuǎn)移。這種特殊的現(xiàn)象已成為一個(gè)較新的技術(shù)，測(cè)量距離遠(yuǎn)低于在光學(xué)顯微鏡的橫向分辨率的基礎(chǔ)。

漂白的發(fā)生，導(dǎo)致FRAP，恢復(fù)或熒光漂白后，被稱為一種技術(shù)。FRAP是基于激光短脈沖串和隨后的恢復(fù)引起的擴(kuò)散到漂白區(qū)域的熒光基團(tuán)的熒光觀察漂白。

熱門抗淬滅試劑的屬性

表2

為了減少在某些試樣的衰退程度，它可能是在光路中，最好使用中性密度過(guò)濾器之前的照明達(dá)到激發(fā)光濾光片，從而減少激發(fā)光的強(qiáng)度。在其他情況下，可能會(huì)降低衰落的影響，通過(guò)改變安裝介質(zhì)的pH值，或通過(guò)使用抗漂白劑（表2中列出了一些比較重要的代理）。對(duì)于數(shù)字成像，顯微攝影，或簡(jiǎn)單地目視觀察，迅速變化的視場(chǎng)也可避免衰退效果。