奧林巴斯顯微鏡：激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

中常用的激光掃描共聚焦顯微鏡的激光是高強(qiáng)度的單色光源，這是有用的工具的各種技術(shù)，包括光學(xué)捕獲，壽命成像研究，光漂白恢復(fù)，和全內(nèi)反射熒光。此外，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的光源，也是最常見的，并已動(dòng)用，雖然次數(shù)不多，在傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)熒光調(diào)查。

激光器發(fā)出強(qiáng)烈的包單色光的協(xié)調(diào)性和高度平行，形成一個(gè)嚴(yán)密的光束，以非常低的速度擴(kuò)張。比起其它光源，由激光發(fā)射極純的波長(zhǎng)范圍鹵鎢燈或電弧放電燈是無與倫比的帶寬和相位關(guān)系。其結(jié)果是，激光束可以在長(zhǎng)距離行駛，并可以擴(kuò)展到填充孔或聚焦到一個(gè)非常小的點(diǎn)具有高的亮度水平。除了共同所有的激光器，其中包括增益介質(zhì)（光源），激勵(lì)源（電源）和諧振器的相似之處，這些光源根本不同的規(guī)模，成本，輸出功率大，光束質(zhì)量好，功耗和運(yùn)行壽命。

大多數(shù)激光系統(tǒng)產(chǎn)生的相干單色光引入了經(jīng)典的廣角鏡的應(yīng)用，這些光源的問題。所引入的干擾，在光路中的每一個(gè)表面的光散射和衍射圖案。此外，字段和孔徑光闌，以及污垢，也產(chǎn)生偽影。的各種技術(shù)，可以最小化或消除這些不期望的效果。最常用的方法，包括時(shí)間上的加擾的激光的光源和顯微鏡的光路長(zhǎng)度之間的快速變化，或者試樣逐點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)中的情況一樣，。此外，往往可以消除干擾和其他文物的光圈掃描技術(shù)。如果路徑長(zhǎng)度或相干態(tài)的激光束的波動(dòng)，以更快的時(shí)間間隔比檢測(cè)器的積分時(shí)間（在效果上的視頻幀速率），散斑散射偽影從圖像中消失的。

受雇于一些調(diào)查，以改善微分干涉對(duì)比（DIC）用氬離子激光光源產(chǎn)生的圖像是一個(gè)成功的技術(shù)來定位圓形玻璃楔形，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)每分鐘，在光路中。迅速變化，光路長(zhǎng)度被引入楔厚度的不同楔形前面擴(kuò)展的激光束旋轉(zhuǎn)。目前，路徑長(zhǎng)度的變化通常是通過采用光纖的光管路由之間的光的光源和顯微鏡。振動(dòng)的纖維產(chǎn)生的光路長(zhǎng)度在不斷變化，使光束成為在時(shí)間上不連貫的，在以下的頻率的振動(dòng)能級(jí)?？赡軙?huì)產(chǎn)生的振動(dòng)的壓電裝置，揚(yáng)聲器，或用于在激光頭的冷卻風(fēng)扇。

圖1中所示，是一種自鎖模鈦：藍(lán)寶石脈沖激光，這是目前的優(yōu)選激光激發(fā)源中的多數(shù)的多光子熒光顯微鏡調(diào)查。鈦藍(lán)寶石鎖模激光器提供了大量的波長(zhǎng)調(diào)諧范圍，從約690到1050納米，脈沖寬度，長(zhǎng)度約100飛秒。此外，這些激光器具有足夠的功率（大于100毫瓦整個(gè)調(diào)節(jié)范圍內(nèi)），在大多數(shù)的熒光基團(tuán)的雙光子激發(fā)的飽和。為了確保正常冷卻和濕度控制的激光晶體，被泵入氮?dú)饷芊獾募す忸^，這是由外部冷卻器保持恒溫。

許多激光系統(tǒng)通過產(chǎn)生的光的直線偏振光的偏振矢量垂直取向。這個(gè)屬性可以利用應(yīng)用程序中需要偏振光照明源，如微分干涉相襯，偏振光測(cè)量，或定量的調(diào)查，熒光偏振各向異性。

連貫性和偏振特性的激光束的光束的橫截面，或檔案中的激光的出射反射鏡的距離的增加，從而改變光的分布的量。下面討論激光束的特點(diǎn)，提出作為一般了解的主題，采用激光在顯微鏡成像，激光俘獲和其他應(yīng)用程序可能會(huì)被證明是有用的。

當(dāng)激光工作在最簡(jiǎn)單的橫向電磁模式，簡(jiǎn)稱為TEM模式（00） ，所發(fā)射的光束的平面波前 和高斯強(qiáng)度（照度）的配置文件。激光束的直徑通常被定義為E（E-2）（13.5％），其峰值強(qiáng)度已經(jīng)下降到值。的高斯分布的激光束的產(chǎn)生，是因?yàn)?a title='衍射' target='_blank' href='http://www.master158.com/xinwen/476.html' class='seolabel'>衍射，從而防止一個(gè)完美的準(zhǔn)直光束的傳播，并誘導(dǎo)橫向傳播的光的波。附近的激光的輸出孔（稱為近場(chǎng)），相臨的光束變得紊亂。其結(jié)果是，光束的橫截面形狀，尺寸，和輻照剖面然后迅速變化的激光的距離。在更遠(yuǎn)的距離（遠(yuǎn)場(chǎng)），由此產(chǎn)生的高斯分布相戰(zhàn)線穩(wěn)定。在一些文獻(xiàn)中，被稱為近場(chǎng)和遠(yuǎn)場(chǎng)菲涅耳區(qū)和夫瑯和費(fèi)區(qū)的替代條款，分別。近場(chǎng)有時(shí)也被稱為的瑞利范圍內(nèi)。在遠(yuǎn)處，?，定義為遠(yuǎn)場(chǎng)開始

?= 0 2 /λ

A（0）是在出射孔徑的光束直徑，和λ是由激光發(fā)出的光的波長(zhǎng)。應(yīng)用這個(gè)方程時(shí)散發(fā)出0.6毫米的腰部直徑的光束在波長(zhǎng)為488納米的氬離子激光的遠(yuǎn)場(chǎng)開始從出射孔徑約74厘米。

圖2給出的是激光束的幾何形狀和在近場(chǎng)和遠(yuǎn)場(chǎng)發(fā)散角的概略圖。如上所討論的，光束可以被認(rèn)為本質(zhì)上是一個(gè)經(jīng)歷很少在近場(chǎng)傳播的波陣面的平行束。超出了近場(chǎng)中的光束發(fā)散角（θ）的光束從中心到邊緣（E（E-2） ） ，這是衡量，越來越大，成為在確定光束的直徑（D）的最重要的參數(shù)，根據(jù)等式：

光束直徑（D）= 2L?tan（θ）

e變量標(biāo)志著激光束的直徑，L表示從激光出口孔徑在橫梁上的測(cè)量點(diǎn)的距離的長(zhǎng)度。在實(shí)踐中，多個(gè)激光束的特性，包括輻照剖面，是在許多顯微鏡應(yīng)用的關(guān)鍵因素，并在配置的攝像系統(tǒng)的知識(shí)的遠(yuǎn)場(chǎng)的距離可能是必要的。表一列出一些普遍使用的激光和發(fā)射線，典型的光束束腰直徑的距離（使用上面給出的方程）的計(jì)算值。

距離遠(yuǎn)場(chǎng)

表1

無論光束展品高斯字符大多數(shù)激光應(yīng)用程序是很重要的，因?yàn)楣馐幸约?，形，透鏡等光學(xué)元件以其他方式修改。高斯光束具有某些可定義的變換特性，這些使能的假設(shè)，通過光學(xué)系統(tǒng)的光束將如何傳播的。

角半徑（或光束發(fā)散角，見圖2），指定由θ（弧度），高斯光束的遠(yuǎn)場(chǎng)近似表達(dá)式：

θ=λ/ΠA 0

（0）是在激光出射孔徑的光束束腰半徑。束腰直徑的激光波長(zhǎng)，諧振腔長(zhǎng)度，和其它設(shè)計(jì)參數(shù)的空腔是一個(gè)函數(shù)。從激光的距離（z）的增加，光束束腰半徑由下式給出：

（Z）=θ ?

通常情況下，激光束的光束傳播參數(shù)，如M，K表（這是相等于M的平方的倒數(shù)）的平方，從近場(chǎng)和遠(yuǎn)場(chǎng)測(cè)量如下的組合確定其特征在于：

M 2 =πA 0 θ/4λ

較小的值，這被稱為一個(gè)傳播常數(shù)或傳播因子，M 2的高光束質(zhì)量的指標(biāo)，特別是在更小的直徑和發(fā)散參考。因子描述真實(shí)的光束的關(guān)系的一個(gè)理想的高斯光束。

相干高斯光束具有特定的屬性，導(dǎo)致他們不同于非相干光光束的傳播和轉(zhuǎn)化的透鏡和反射鏡。的衍射極限的光束的情況下，高斯光束的強(qiáng)度分布是高斯分布，提供光束通過鏡頭的光圈值不被截?cái)?。?dāng)高斯光束直徑的二分之一的鏡頭孔徑，出射光束的強(qiáng)度分布保持高斯。當(dāng)高斯光束直徑等于鏡頭的光圈的直徑，輸出光束的強(qiáng)度分布是高斯函數(shù)的艾里斑的混合物。最后，一個(gè)高斯光束的直徑明顯大于鏡頭的光圈的直徑產(chǎn)生的艾里斑的輸出的檔案。在后一種情況下，激光功率可能會(huì)丟失由于透鏡入射孔徑滿溢。

高斯光束的光學(xué)系統(tǒng)的總體主題是徹底覆蓋在眾多的教科書，可以從更全面的來源和細(xì)節(jié)這里就不討論了。高斯光束的兩種類型的操作是特別感興趣的顯微鏡，利用激光- 束濃度和擴(kuò)束。

當(dāng)激光束聚焦到一個(gè)非常小的光斑的像差顯微鏡物鏡（梁濃度）的焦點(diǎn)（在距離z）的光斑半徑的表達(dá)式由下式給出：

（Z）=λ f /ΠA 0

其中，f是透鏡的焦距。作為一個(gè)例子，如果一個(gè)100x物鏡的數(shù)值孔徑為1.3（約1.6毫米的焦距）集中的488納米的氬離子激光束的具有半徑為0.3毫米，聚焦光點(diǎn)半徑（決定從前面的方程）是0.8微米。增加光束腰通過擴(kuò)束（在下面討論）的5倍，將導(dǎo)致在聚焦光點(diǎn)半徑的約0.16微米。

重要的是要注意，非常高的功率密度達(dá)到濃縮的激光束的焦點(diǎn)。10毫瓦的光束聚焦到衍射極限的光點(diǎn)0.22微米直徑的結(jié)果，在約30百萬瓦特每平方厘米的功率密度。這樣高的能量水平，可以迅速降解或破壞透鏡和功能涂料，以及引入相當(dāng)大的光化學(xué)損傷的生物樣本。然而，對(duì)于這樣的微小光點(diǎn)的大小，可以是熱能的擴(kuò)散在水中可能做一個(gè)高能量的近紅外線光束的試樣吸收的能量足夠高的生物試樣的損傷小，除非如此有效。

在許多應(yīng)用中的激光器在光學(xué)顯微鏡中，激光束擴(kuò)展所使用的開普勒或伽利略擴(kuò)束器的，其中任何一個(gè)實(shí)際上是一個(gè)反轉(zhuǎn)的望遠(yuǎn)鏡（典型的激光擴(kuò)束器解剖特征，圖3中所示）。相干高斯光束的發(fā)散性可被減小，并優(yōu)化在一個(gè)較長(zhǎng)的距離，準(zhǔn)直的光束，如果激光束被第一膨脹。參見上述方程，光束的角半徑，θ指定的光束束腰半徑，（0） ，在激光出射孔徑成反比。因此，擴(kuò)大束腰半徑減小比例的分歧。

顯微鏡管直接進(jìn)入顯微鏡的光路的激光輸出通過一個(gè)靈活的光纖（如在圖4中示出）的許多應(yīng)用中，很實(shí)用。這種技術(shù)是最好的替代方法，嚴(yán)格對(duì)齊，這就需要采用一個(gè)巨大的，無振動(dòng)的光學(xué)平臺(tái)和眾多的固定反射鏡和其他組件的激光和顯微鏡。

當(dāng)激光束被聚焦到一個(gè)光纖的透鏡的耦合效率，從纖維束的特性在很大程度上依賴于纖維的幾何形狀。利用激光光傳輸?shù)墓鈱W(xué)纖維的構(gòu)造與稠合的二氧化硅纖芯。這些纖維包括具有高折射率的二氧化硅制造的內(nèi)芯，將由套筒環(huán)繞的，被稱為包層的折射率低的材料組成。防止光逸出的纖維沿其長(zhǎng)度方向的纖芯和包層的界面處的全內(nèi)反射。包層可以由二氧化硅，玻璃，硬的含氟聚合物，或柔軟的聚硅氧烷。

單模或者多模光纖被分類為根據(jù)其內(nèi)芯的直徑。甲單模光纖允許僅在最低階模式的傳播，在一個(gè)特定的波長(zhǎng)（圖4）。傳播的波長(zhǎng)和波的極化保存由纖維直徑。雖然其他波長(zhǎng)的傳播，他們這樣做效率降低。典型的單模光纖的直徑范圍從3到6微米的可見光的波長(zhǎng)，和輸出的單模光纖的輻照剖面是高斯分布。

一種多模光纖中的一個(gè)以上的模式中，使傳播，并且不局限于單一波長(zhǎng)。多模光纖的內(nèi)芯是大于，取值范圍從大約100微米到1.2毫米直徑的單模光纖。從多模光纖的輸出輻照剖面的扁平形狀，簡(jiǎn)稱為頂帽檔案中，數(shù)值孔徑，是由纖芯和包層的折射率。

接受的錐角θ，相關(guān)的光纖芯的纖維的數(shù)值孔徑NA，如下：

其中?表示折射率。當(dāng)光纖纖芯的數(shù)值孔徑和光束濃度透鏡相匹配時(shí)，會(huì)發(fā)生的激光光的光纖芯的高效耦合。通常是通過光纖的光傳輸效率高達(dá)約90％，但也可以大幅減少（只有60％或70％）具有非常小的半徑（小于3厘米）的彎曲。

在利用任何激光，這是至關(guān)重要的，不僅是為了防止任何直接或鏡面反射的激光光線進(jìn)入觀察者的眼睛，也能避免反射的光束的光學(xué)系統(tǒng)返回到激光系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。前者是一個(gè)明顯的人身安全預(yù)防措施，而后者謹(jǐn)慎重要的是防止返回相干光束返回到激光，可能導(dǎo)致?lián)p壞系統(tǒng)的一個(gè)額外的反射器。

穩(wěn)定性的激光光源是在許多應(yīng)用中的一個(gè)重要方面，尤其是在定量顯微鏡，照度波動(dòng)產(chǎn)生不利影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一些有關(guān)的受激發(fā)射和諧振腔長(zhǎng)度的波動(dòng)因素可誘導(dǎo)的輸出光束中的頻率的噪音，但可以創(chuàng)建其他擾動(dòng)引起的幅度波動(dòng)高頻的強(qiáng)度噪聲和光輸出功率的緩慢變化（漂移）。這些強(qiáng)度波動(dòng)的某些源與激光頭本身或電源的功能。最常見的來源噪聲輸出光束各種激光類別列示如下：

· 氣體激光器 -諧振器的振動(dòng)，噪聲光泵浦源，等離子振蕩，離子放電過程中的不穩(wěn)定性，電源電流的波動(dòng)，從冷卻水湍流顫，風(fēng)冷系統(tǒng)和風(fēng)扇引起的噪聲鏡失調(diào)潛在的噪聲源。

· 固態(tài)激光器 -噪聲源包括顫，泵源燈和二極管泵腔對(duì)準(zhǔn)誤差和隨機(jī)頻率相關(guān)的噪聲（稱為1 / F噪聲），是關(guān)系到激光介質(zhì)的熱波動(dòng)波動(dòng)。

· 染料激光器 -這兩種噪聲（高頻）和漂移造成的密度不均勻性和在染料溶液中的氣泡，染料泵，激光泵源的不穩(wěn)定性。

· 半導(dǎo)體（二極管）激光器噪聲-可能會(huì)導(dǎo)致從驅(qū)動(dòng)器中的波動(dòng)（偏置）電流或溫度和的1 / f噪聲引起的交界處的載流子的俘獲，由其他類型的載流子（電子-空穴）復(fù)合效果。

所有的激光易受電源引入的噪聲， 開關(guān)電源，這已成為常見的，因?yàn)樗麄兊男屎托〕叽缈赡芴貏e介紹紋波激光系統(tǒng)到數(shù)十千赫茲的頻率范圍。這類干擾，當(dāng)它影響的光束在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)中，可能是特別麻煩的診斷與排除。的主要困難是由于噪聲引入到系統(tǒng)中由其它來源，如在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的電磁場(chǎng)之間的相似性。為了實(shí)現(xiàn)足夠的輸出穩(wěn)定性，半導(dǎo)體激光器必須具有最高的電穩(wěn)定性和最低的噪聲可與二極管電流供應(yīng)操作，并且具有精確的溫度控制。其他外部噪聲源必須加以控制，包括在實(shí)驗(yàn)室中的灰塵和震動(dòng)，源于當(dāng)?shù)氐慕煌ê徒ㄖO(shè)備。

可以穩(wěn)定的任一電子控制的管電流，或通過利用外部元件的光強(qiáng)度調(diào)制的連續(xù)波（連續(xù)波）激光束強(qiáng)度。通常采用兩種不同的方法，以控制管的驅(qū)動(dòng)電流。在恒流模式下，管電流直接控制由一個(gè)電子反饋回路，以減少波動(dòng)。由于激光輸出也隨溫度變化，這種類型的控制電路是最有效的，如果提供足夠的溫度控制， 通過控制驅(qū)動(dòng)電流的恒定輸出功率穩(wěn)定系統(tǒng)運(yùn)營(yíng)響應(yīng)于來自電路的信號(hào)進(jìn)行采樣的輸出光束分束器和光電二極管顯示器。這種物理的安排適用于氣體激光器和其他一些幾何形狀，但更小的激光二極管通常組裝在包中已經(jīng)包括一個(gè)整體的光電二極管的。的監(jiān)視器光電二極管樣品從后側(cè)面的激光晶片發(fā)射，并產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，使反饋控制的輸出功率。

用于提供穩(wěn)定的激光強(qiáng)度的外部元件通常采用快速的反饋系統(tǒng)來控制的電-光調(diào)制器，束功率波動(dòng)最小化。普克爾盒外部調(diào)制器（見圖5）是可從許多制造商，并且可以使用，在原則上，任何連續(xù)波激光的輸出功率穩(wěn)定。可以用這種技術(shù)校正大強(qiáng)度的波動(dòng)（高達(dá)約50％），但在總輸出功率按比例減少。廣泛的糾錯(cuò)能力與許多系統(tǒng)是很重要的。氦鎘激光，例如，可以表現(xiàn)出20％左右的輸出功率變化，部分原因是由于強(qiáng)大的等離子振蕩之間有一定的束頻率。系統(tǒng)的存在，據(jù)報(bào)道，適合用于調(diào)節(jié)連續(xù)波鎖模激光器，其輸出功率的百分之幾百分之一內(nèi)，從直流到幾百兆赫的頻率范圍內(nèi)，噪聲衰減500:1，或更大。

普克爾盒的一個(gè)調(diào)制器的基本組成部分，如圖5所示。外部設(shè)備調(diào)節(jié)激光輸出強(qiáng)度，在圖5所示的設(shè)計(jì)相似，有時(shí)被分類或銷售長(zhǎng)期噪聲挑食。利用Pockels效應(yīng)的電光調(diào)制器背后的基本概念是基于一種機(jī)制，用于改變偏振特性的細(xì)胞在以極快的速度，提供一種可變光束衰減器，用于控制激光的強(qiáng)度。的激光輸出的偏振態(tài)確定的調(diào)制器的總衰減量，但高達(dá)80％的傳輸是可能的。從激光頭發(fā)射的光束的一部分由分束器被轉(zhuǎn)移到一個(gè)光電二極管，它的強(qiáng)度進(jìn)行比較，以預(yù)先設(shè)定的（可選的）的基準(zhǔn)強(qiáng)度，和放大的差分信號(hào)，以便它可以驅(qū)動(dòng)的電光普克爾盒調(diào)制器。放大后的信號(hào)產(chǎn)生一個(gè)旋轉(zhuǎn)的偏振面在單元格中的折射率變化，從而改變光束衰減成比例的差分電壓施加。其中表現(xiàn)出變化的偏振特性的物質(zhì)在電場(chǎng)中的變化（Pockels效應(yīng)）的磷酸二氫鉀，鈮酸鋰，并在光束調(diào)制器通常利用這些材料的晶體。

隨機(jī)偏振的光的情況下，由普克爾盒系統(tǒng)是穩(wěn)定的，調(diào)制器必須被定位在交叉的偏振器之間，以及進(jìn)一步的考慮是必要的，以盡量減少這些額外的元件上的光束的穩(wěn)定性的影響。由于灰塵，振動(dòng)，和其它干擾，可以在任何點(diǎn)的光路中，改變光束的穩(wěn)定性是重要的，外部的穩(wěn)定劑被放置在盡可能靠近試樣位置在光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)。這方面的努力，以確保最穩(wěn)定的光束被傳遞到試件。

無論是氬離子激光器，氪離子激光的發(fā)射線產(chǎn)生多個(gè)功率電平有很大的差別，從稀有氣體的轉(zhuǎn)換，只有少數(shù)的線適合于顯微鏡應(yīng)用。被廣泛采用空氣冷卻的氬離子激光作為光源的共聚焦顯微鏡，因?yàn)槠淞炼入娖剑w積小，優(yōu)良的光束的幾何形狀，熒光素和羅丹明（效率降低）激發(fā)的譜線的適用性。大多數(shù)在寬視場(chǎng)或共聚焦熒光顯微鏡利用氬離子激光器發(fā)射兩個(gè)可用的線，488和514.5納米，這表示大約75％的總激光功率。高功率（大于5瓦）配備了特殊的反光鏡氬離子激光器能發(fā)出紫外光線，334，351，和364納米，以及額外的線延伸，從458到529納米的可見光波長(zhǎng)。

氪離子激光器，氬激光器相比，由于他們有點(diǎn)長(zhǎng)波長(zhǎng)輸出在顯微鏡的應(yīng)用較少。此外，氪氣如氬氣，使用時(shí)，在同一管盡可能多的功率只產(chǎn)生10?30％，往往需要冷卻水，以產(chǎn)生空氣冷卻的氬氣系統(tǒng)的等效功率輸出。風(fēng)冷離子激光器的一個(gè)主要缺點(diǎn)是缺乏效率的，這導(dǎo)致大的功率要求和產(chǎn)生過多的熱量通過強(qiáng)制空氣排氣扇，必須從系統(tǒng)中刪除。離子激光器的壽命的降低是由于氣體的消耗，與被困埋氣體放電管的壁內(nèi)作為激光手術(shù)所需的高電流密度的結(jié)果。

使用氬氪混合物風(fēng)冷激光器在激光共聚焦顯微鏡已成為流行，幾枚照明波長(zhǎng)時(shí)，都需要雙重或多重?zé)晒獾难芯俊＿@種混合氣體激光器只能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的輸出主要是很好的波長(zhǎng)光譜分離。通常利用激光共聚焦顯微鏡的三個(gè)激光線，488納米和568納米線具有大致相等的電源（10?15毫瓦），而在647納米線具有約50％以上（15?25毫瓦）。所有離子激光器具有光束質(zhì)量?jī)?yōu)異，可以購(gòu)買各種廠家單線，多線，可調(diào)配置。

常見的氦氖激光發(fā)射633納米（稱為氦氖線）已發(fā)展具有綠色（543納米），黃色（594納米），橙色（612納米）的排放量的變種，并輔以（1523納米）的近紅外光譜范圍內(nèi)。雖然大多數(shù)的這些激光器的發(fā)射器和單行相對(duì)較低的功率（小于10毫瓦），氦-鎘激光器是一個(gè)例外，在325或442納米具有大于50毫瓦的功率發(fā)射。

氦鎘激光器（如圖6所示）被認(rèn)為是氦-氖家庭的成員，并代表一種經(jīng)濟(jì)的連續(xù)波輸出源中的紫外線（325納米，在75毫瓦和353在20毫瓦）和紫色（442納米，在200毫瓦）光譜區(qū)域。依靠這些激光器作為激光介質(zhì)，均勻地從加熱鎘儲(chǔ)層的孔分布（約250度），通過氣相電泳鎘蒸氣。氦氣泵保持恒定的氦氣的壓力，這是高于鎘蒸汽一千倍左右。氦鎘激光束噪聲顯示更多比氦氖同行，主要是因?yàn)榻饘冁k濃度蒸氣孔的局部波動(dòng)。他們也有壽命較短，一般約5000個(gè)工作小時(shí)。

一組研究者描述了一個(gè)比成像耦合到在氬激光器工作在488納米和442納米的氦-鎘激光器發(fā)射的激光共聚焦顯微鏡的使用。此系統(tǒng)允許組測(cè)量的強(qiáng)度比，從pH值敏感的染料BCECF [ IUPAC名稱具有2'，7'-雙- （2 -羧基乙基）-5 - （6） -羧基熒光素]在隔離腎小管。已經(jīng)作出了類似的測(cè)量，利用458納米線的氬激光廣角和共聚焦顯微鏡系統(tǒng)。另一位研究人員報(bào)告說，使用325納米的氦鎘激光輸出同時(shí)激發(fā)兩種染料和執(zhí)行排放比成像。

氦氖激光器廣泛的生物醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用中使用最廣泛的激光系統(tǒng)，并顯示最優(yōu)越的任何激光的高斯光束質(zhì)量。這些激光器很容易在相對(duì)較低的成本，具有緊湊的尺寸，并具有使用壽命長(zhǎng)（通常達(dá)到40,000到50,000小時(shí)）。低功耗的要求，卓越的光束質(zhì)量（實(shí)際上是一個(gè)純高斯分布），和簡(jiǎn)單的冷卻要求（對(duì)流）使氦氖激光器的許多共聚焦顯微鏡的選擇系統(tǒng)。

圖7中給出的是一個(gè)典型的氦氖激光器系統(tǒng)，它是用玻璃構(gòu)成的，具有大的氧化鋁冷陰極作為電子發(fā)射體的剖開圖。操作中的異常輝光電流密度氣體放電區(qū)域，氦-氖激光器一般為高電壓和低電流系統(tǒng)，與放電電流被限制到幾毫安和范圍從幾百至幾千伏的電位。進(jìn)行性惡化，最終導(dǎo)致濺射的鋁，在陰極上的氧化物涂層是氦氖激光器的工作壽命的限制因素。大直徑放管通常比小管與約10000小時(shí)（40,000小時(shí)），分別有更長(zhǎng)的壽命。

氮激光一直沿用了很多年，作為脈沖光源光譜和顯微鏡。輸出被限制在一個(gè)單一的線，有337.1納米的波長(zhǎng)，脈沖持續(xù)時(shí)間從皮秒到納秒。的脈沖重復(fù)頻率可高達(dá)每秒200個(gè)脈沖。氮激光器，也可采用發(fā)射波長(zhǎng)較長(zhǎng)的泵的染料分子。此外，這些激光器已被利用作為光源使用的Fura-2的紫外線激發(fā)染料用于高速比鈣成像。在此應(yīng)用中，使用兩個(gè)激光器，一個(gè)作為337納米的光的直接來源，而另一個(gè)是染料泵浦產(chǎn)生380納米的發(fā)射。每個(gè)激光脈沖的重復(fù)頻率為15幀每秒，在與視頻速率同步，產(chǎn)生一個(gè)比圖像的時(shí)間間隔為66毫秒，一次。

二極管激光器，半導(dǎo)體器件，幾十年來一直在開發(fā)，現(xiàn)已有足夠的輸出功率是顯微鏡的興趣。在這些設(shè)備中，最常見的工作在近紅外區(qū)，但在紅色和藍(lán)色區(qū)域（最近，其它波長(zhǎng)的光），與大的輸出功率的二極管激光器，已被開發(fā)。此外，現(xiàn)在這些二極管激光器，提供具有改善的光束形狀和穩(wěn)定性，使他們能夠在許多應(yīng)用中取代氦氖激光器。二極管激光器通常介于10,000和50,000小時(shí)的壽命，但靜電沖擊是極其敏感的，所以他們必須小心處理。

極大的興趣光學(xué)顯微鏡可調(diào)諧二極管激光器的發(fā)展，這方面的權(quán)力和多功能性與可調(diào)諧染料激光器和摻鈦藍(lán)寶石激光器（下面討論如圖1所示），現(xiàn)在可以競(jìng)爭(zhēng)?？烧{(diào)諧染料激光器有600至1800納米的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，并且可以提供5到25毫瓦的功率。它們的優(yōu)點(diǎn)在于，消除了對(duì)于外部冷卻系統(tǒng)的要求相對(duì)較低的成本，尺寸緊湊，壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，和低發(fā)熱量的生產(chǎn)。

二極管泵浦固態(tài)激光器（DPSS）利用二極管激光器代替惰性氣體，弧光燈或閃光燈泵固態(tài)激光材料。二極管泵浦激光器的氣體（氦-氖）激光的方法，所表現(xiàn)出的功率輸出，光束質(zhì)量和穩(wěn)定性，但與二極管激光器的效率和尺寸。二極管泵浦激光器的典型的操作和維護(hù)成本是小于氣體激光器，大多數(shù)系統(tǒng)中，可以通過對(duì)流或強(qiáng)制空氣冷卻。

二極管泵浦的釹-釔鋁石榴石（Nd：YAG激光器）激光器產(chǎn)生毫瓦的功率范圍在1064納米的光。倍頻導(dǎo)致一個(gè)緊湊的設(shè)備，在532納米的連續(xù)波輸出，也可以采用在355納米，以產(chǎn)生脈沖輸出的頻率的三倍。緊密折疊諧振器（TFR）抽釹氟化釔鋰晶體具有高功率和效率產(chǎn)生幾瓦的功率，在1047納米的激光二極管陣列（的Nd：YLF）。倍頻，三倍，四倍這種類型的激光功率輸出高達(dá)幾百毫瓦的相干光時(shí)，523，349，和262納米（第二，第三和第四次諧波）。二極管激光器作為泵浦源的其他優(yōu)點(diǎn)包括延長(zhǎng)壽命（通常為5000小時(shí)以上，比幾百個(gè)小時(shí)的燈），準(zhǔn)直的和容易集中的輸出相匹配的固態(tài)激光器的激射體積小，并大大減少，這通常要求水冷卻時(shí)，鹵素弧光燈被用作泵激光棒的熱負(fù)荷。

二極管泵浦全固態(tài)激光器的發(fā)展，推動(dòng)了工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用需要高功率（一般在幾瓦）綠色（532或523納米）和紫外線（355納米或349納米，266納米和第四諧波）波長(zhǎng)范圍。在紫外光譜區(qū)的輸出脈沖能量范圍從100微焦耳至10毫焦，脈沖持續(xù)時(shí)間在納秒級(jí)，高達(dá)10 kHz的重復(fù)率。這些激光器是非常有用的，在顯微鏡的觸發(fā)籠狀化合物的釋放。然而，脈沖重復(fù)率，仍然太慢用作大多數(shù)共聚焦顯微鏡應(yīng)用的照明源。

相結(jié)合的二極管泵浦固態(tài)激光器與光參量振蕩器（OPO的進(jìn)一步發(fā)展，見圖8）產(chǎn)生可調(diào)，脈沖輸出是連續(xù)可變的，從205納米到2000納米。雖然最初可用的系統(tǒng)是昂貴和復(fù)雜的操作，更適合在顯微鏡中使用的按比例縮小的版本被引入。

摻鈦藍(lán)寶石激光器（俗稱鈦藍(lán)寶石激光器，見圖1）提供可調(diào)諧脈沖和連續(xù)光傳輸，以及固態(tài)可靠性的優(yōu)勢(shì)。這些激光器在高重復(fù)頻率（100MHz時(shí)），可以提供很短的光脈沖（約80至100飛秒）。的范圍內(nèi)可調(diào)諧的波長(zhǎng)從遠(yuǎn)紅延伸到近紅外光譜區(qū)域（700至1000納米）。大多數(shù)這些激光器的操作與由大功率氬激光器的光泵浦，以及需要水冷卻。由于涉及操作和維護(hù)摻鈦藍(lán)寶石激光器的費(fèi)用和復(fù)雜的結(jié)果，它們的使用已主要限于在相對(duì) 少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室多光子顯微鏡。

最近，一個(gè)二極管泵浦的Cr：LISAF（鉻摻雜鋁鍶鋰氟化物）激光已被開發(fā)，可提供高頻90飛秒激光脈沖的波長(zhǎng)為860納米，平均輸出功率為88毫瓦。小尺寸和低功耗要求鉻：LISAF激光使之成為一個(gè)有吸引力的多光子熒光顯微鏡的光源代替鈦：藍(lán)寶石激光。

結(jié)論

其中多光子和激光共聚焦熒光顯微鏡之間的主要區(qū)別是這些經(jīng)常是互補(bǔ)的技術(shù)利用激光的類型。多光子顯微鏡的激光是相當(dāng)昂貴，且難以操作比小型風(fēng)冷激光共聚焦顯微鏡采用。

用戶友好的的交鑰匙激光源多光子顯微鏡的發(fā)展是必要的，如果該技術(shù)注定得到廣泛接受。到今天為止，的多光子調(diào)查的范圍是有限的，所提供的合適的激光照明光源的激發(fā)波長(zhǎng)的選擇有限制。為了緩解復(fù)雜的激光日常維護(hù)時(shí)間表，擴(kuò)大有用的激發(fā)波長(zhǎng)的光譜，在持續(xù)飛秒光脈沖激光器的新發(fā)展是必不可少的。具體而言，新的激光源必須被設(shè)計(jì)的波長(zhǎng)可調(diào)諧的整個(gè)上可見（500納米）和近紅外部分頻譜。

在過去十年中，許多新的短脈沖激光系統(tǒng)變化可能發(fā)現(xiàn)克爾透鏡鎖模摻鈦藍(lán)寶石晶體激光器。其他新的系統(tǒng)，如二極管泵浦固態(tài)和單模光纖飛秒激光器正在調(diào)查他們的潛能作為激發(fā)源多光子顯微鏡。在未來，倍頻飛秒脈沖激光器的光學(xué)參量振蕩器（OPO的），可提供一個(gè)通用的解決方案覆蓋有用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)。

應(yīng)用現(xiàn)狀顯微鏡激光共聚焦顯微鏡，光學(xué)誘捕籠化合物和熒光基團(tuán)，并釋放領(lǐng)域的迅速擴(kuò)張。緊湊的固態(tài)激光器的發(fā)展與藍(lán)綠色和紫外線光譜區(qū)的發(fā)射線應(yīng)該在顯微鏡有助于進(jìn)一步提高這些設(shè)備的利用率。