尼康顯微鏡：活細胞成像對光學系統(tǒng)和CCD的要求

在活細胞研究設計的光學顯微鏡系統(tǒng)，主要考慮檢測器的靈敏度（信號與噪聲），圖像采集所需要的速度，以及標本的可行性。相對較高的光照強度和較長的曝光時間，通常采用固定的細胞和組織（如漂白是主要的考慮因素）中記錄圖像時，必須嚴格避免與活細胞。在幾乎所有的情況下，活細胞顯微代表了一種妥協(xié)之間實現(xiàn)最佳的圖像質(zhì)量和保持健康的細胞。不必要的過采樣的時間點，使細胞含量超標的照明，空間分辨率和時間分辨率的實驗，而不是應限制在調(diào)查的物鏡相匹配的。

原則上，理想的活細胞圖像采集系統(tǒng)是不夠敏感，從弱熒光樣品，同時足夠快的速度來記錄所有動態(tài)過程，獲得高品質(zhì)的圖像。此外，該系統(tǒng)將有足夠的分辨率捕捉最細微的標本細節(jié)能夠準確測量非常微小的差異在強度和較寬的動態(tài)范圍。不幸的是，僅完成優(yōu)化這些條件中任一項在犧牲其他。因此，目前不可能設計一個通用的活細胞成像系統(tǒng)，這將是理想的整個范圍內(nèi)的可能的調(diào)查。相反，研究人員必須妥協(xié)，確定最重要的參數(shù)進行優(yōu)化，同時還試圖限制由這些變量被認為不太感興趣的犧牲。顯微鏡配置在最后，最終確定所要求的攝像模式（s）時，生活必需品保持試樣在實驗期間，標記協(xié)議的難度級，和設備的可用性的可行性。

示于圖1，是一個現(xiàn)代的倒置研究級組織培養(yǎng)顯微鏡配備4相機端口，每個端口耦合到一個不同的相機設計用于特定的成像模式。在大多數(shù)情況下，這種設計直接是100％的端口（一個端口在同一時間）的光顯微鏡或分裂的相機端口和目鏡的光80:20之間。對于在低光照水平的關(guān)鍵的成像，研究者應確保最敏感的相機被連接到一個端口接收由樣品發(fā)射的光100％。在圖1中，全彩色CCD相機連接到的底部端口（一）接收來自物鏡的光不反射的反射鏡或棱鏡，并在這種情況下，采用圖像乘以在明視場模式下的標記的熒光的標本（或染色標本） 。高性能電子乘以數(shù)字（EMCCD）相機（二）安裝到右側(cè)端口上使用的圖像標本顯示出非常低的水平的熒光。微分干涉對比成像深入厚的組織與紅外照明，照相機（（c）的左側(cè)端口））具有傳感器具有高的量子效率在700和1000納米之間是必需的。最后，用于高分辨率單色成像通過全內(nèi)反射和其他熒光技術(shù)，珀耳帖（Peltier）冷卻的攝像頭（（四）;前端口）相對小的像素（6微米）是理想的。的配置，如在圖1中所示的是昂貴的，但也可以是極其通用的核心成像設施。

使用廣泛的對比增強成像模式，在光學顯微鏡進行活細胞成像。調(diào)查的大部分涉及某種形式的熒光顯微鏡，往往聯(lián)接到一個或多個發(fā)送的光技術(shù)。熒光技術(shù)，包括傳統(tǒng)的寬視場落射熒光，激光掃描共聚焦，旋轉(zhuǎn)盤，橫掃領(lǐng)域聚焦，多光子，全內(nèi)反射（TIRF），熒光相關(guān)光譜，熒光壽命成像（FLIM），光活化，和激光捕獲。作為一個子集，專門的成像方法，如多色成像，光譜成像，共定位，延時序列，漂白恢復技術(shù)（FRAP，FLIP FLAP），共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），斑點顯微鏡（FSM），膜片鉗往往是耦合到主成像模式中的一個或多個?？梢暂o以熒光技術(shù)傳統(tǒng)的明視場模式下，包括微分干涉相差（DIC），霍夫曼調(diào)制反差（HMC），相位相反的，作為熒光探針本地化的確認。在幾乎所有情況下，每個的顯微鏡配置需要一些獨特的考慮，必須實現(xiàn)成功的活細胞成像。無論顯微鏡和成像活細胞和組織采用的數(shù)字照相機系統(tǒng)，兩個最重要的限制因素是維持細胞生存力和實現(xiàn)可能的最高信號電平以上的背景噪聲和自發(fā)熒光。

優(yōu)化信號與噪聲在活細胞成像

成像固定和活細胞之間的基本區(qū)別之一是，前者的研究者提供了充足的緯度定義圖像采集參數(shù)，如尋找一個合適的視野，并確定曝光時間，以及調(diào)整電子增益設置，讀出率，和偏移值。其結(jié)果是，它在大多數(shù)情況下是可能的（與充分染色固定標本）獲取利用的全動態(tài)范圍的照相機系統(tǒng)的圖像，從而產(chǎn)生最佳的信號 - 噪聲比。不幸的是，情況是不同的成像參數(shù)所施加的嚴格要求，保持細胞活力，活細胞的限制。常常與活細胞的獲得的圖像中，試樣的強度只有幾個灰度級高于背景。在這種情況下，最重要的攝像考慮成為暗電流和讀出噪聲水平的檢測器系統(tǒng)。經(jīng)濟的相機通常具有更高的噪聲水平，導致經(jīng)常掩蓋從檢體，作為增加的讀出速度的效果越來越嚴重的信號不太均勻的背景圖像。在幾乎所有活細胞成像，探測器的選擇是最重要的成功或失敗的實驗。

在數(shù)字成像的噪聲出現(xiàn)的四個主要來源來自檢測器，照明系統(tǒng)，泊松或拍攝的噪聲（由于一個光子通量的隨機性）和雜散光。在大多數(shù)情況下，系統(tǒng)的噪聲減少，可以實現(xiàn)通過仔細選擇的檢測器和優(yōu)化的照明條件。幾乎每一種類型的光子探測器到各測量記錄與設備引入某種形式的噪音。在激光掃描和多光子顯微鏡采用光電倍增管可以產(chǎn)生雜散的電子信號放大系統(tǒng)內(nèi)的。同樣地，使用的電荷耦合器件（CCD的）在寬視場，反卷積，內(nèi)部全反射，旋轉(zhuǎn)盤，和掃頻場顯微鏡顯示出暗電流與每個像素相關(guān)聯(lián)的背景。在CCD和光電倍增管設計的改進，包括冷卻裝置，以非常低的溫度，減少了暗電流的貢獻，以非常低的水平。然而，尤其是在每個像素的CCD的情況下，閱讀和將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字相當于貢獻了額外的噪聲分量被稱為讀出噪聲，在當前一代的冷卻的數(shù)碼相機系統(tǒng)的主要噪聲偽像。

如圖2所示，在活細胞成像與讀出速度和圖像質(zhì)量是相互依存的數(shù)字攝像機的靈敏度。標本是一種文化的人宮頸癌細胞（HeLa細胞線）表達的融合熒光蛋白基因和人α -微管蛋白的寬視場成像中的熒光照明與TRITC濾光鏡組合和灰度攝像系統(tǒng)工作在讀取速度，單體Kusabira橙色（人民圣戰(zhàn)者組織）10或1.25兆赫。當相機CCD關(guān)門（接收沒有光），背景噪聲是顯著降低時，采用的讀出速度慢，在圖2（a）和2（b）在分別為10和1.25兆赫的速度，所描繪。這種差異不嚴重影響相機的性能時，曝光時間可以調(diào)整到利用的整個動態(tài)范圍，如在圖2（c）和圖2（d）中提出的圖像類似的質(zhì)量證明。然而，在低光照條件下，讀取速度較慢（圖2（f））提供優(yōu)異的圖像質(zhì)量。在圖2（e）和2條（f）的圖像捕獲約低10倍比那些在圖2（c）和圖2（d）的光強度。減少的照度水平另一個5倍的產(chǎn)生的效果表現(xiàn)得更為明顯，如示于圖2（g）和2（h）中的讀出速度較慢提供了勉強可以接受的圖像（圖2（小時）），而快速讀出模式（圖2（g））沒有。

一個成功的數(shù)字成像實驗需要的空間照明模式的標本是恒定的整個視野之間連續(xù)的影像。根據(jù)照明源，橫跨試樣字段的光學性質(zhì)通常是相當恒定的（稱為空間不變性）顯微鏡使用鎢鹵素燈。然而，在激光掃描顯微鏡，傳送到一個特定的像素的照射劑量可以為每個掃描變化。此外，汞等離子弧放電燈源通常采用在寬視場熒光顯微鏡不提供均勻的強度，在整個頻譜，但在特定的波長，而不是產(chǎn)生離散的高強度的峰。氙氣燈，與此相反，顯示出更為均勻分布的強度分布圖的可見光譜范圍內(nèi)，但在紫外區(qū)域（通常避免在活細胞成像的照明范圍）有缺陷。

組合弧放電燈（例如，金屬鹵化物燈），具有的屬性之間的中間的汞和氙的混合物，顯示出這兩個物種也許是最好的特性，除了提供一個連續(xù)的光譜，從紫外到紅外強大的汞線。不管的光源，照明場可呈現(xiàn)幾乎均勻的通過燈箱和顯微鏡光學火車照明輸入端口之間放置一個光學纖維（或液體光導）。任何剩余的照明梯度整個視野可以通過計算校正使用平場的算法。重要的是要注意，在燈的輸出功率的時間的變化，它可以改變從平均10％，不校正由光學纖維和需要的應用程序的一個穩(wěn)定的電源。

光子通量的測量本質(zhì)上是一個統(tǒng)計過程中，與信號檢測的不確定性因素。稱為泊松或拍攝噪聲（如上面所述）的凈效果是，對于N個光子的測量，不確定性等于N，這也是的信號-噪聲比的平方根。最大化的信號的光子數(shù)（ N ）直接導致在信號與噪聲和圖像對比度的改進。提高信號的最簡單的方法是收集更多的光子，通常是通過采取更長時間的曝光，或通過增加勵磁照明水平，但這些措施也可以增加光毒性和妥協(xié)細胞存活率。第二，也許更有益的選擇，是為了提高探測器的靈敏度。

為了克服低光水平與活細胞成像，現(xiàn)代數(shù)字CCD相機可以配置提供一個實施的過程被稱為分級（詳見圖3和圖8），顯著提高了靈敏度。在正常讀出時，在CCD的像素的量的水平像素的行轉(zhuǎn)移到讀取寄存器中，然后將其按順序分析。在一個離散化的圖像，在圖像傳感器上的基團中，相鄰像素中鄰接的（例如，一個2×2或4×4塊）的信號（光電子）被合并，并分配到一個單一的象素值中讀出的數(shù)組。這是由多個平行的行的像素轉(zhuǎn)移到串行讀寄存器（例如，為2×2 binning和4行4×4像素合并兩行），然后讀取組的2，3，或多個像素一起實現(xiàn)。在2×2像素合并的情況下，有兩倍的分辨率損失，信號增加了四倍，和2倍的改善信號對噪聲。顯然，改善信號的有限的應用中可以顯著，雖然在空間分辨率的成本。

圖3示出的效果相結(jié)合的相鄰像素上的空間分辨率和數(shù)字拍攝的圖像的最終尺寸，使用水平的不斷提高像素合并。標本赤麂鹿皮膚成纖維細胞表達mCherry（pseudocolored紅色熒光蛋白）和人類的β -肌動蛋白，它定位在應力纖維組成的絲狀細胞骨架網(wǎng)絡的融合是一種文化。作為與熒光蛋白標簽，通常觀察到的細胞，顯示優(yōu)越的本地化往往是那些表達的融合產(chǎn)物，在非常低的水平，顯著降低了可用的信號。隨著沒有像素合并啟用（圖3（a）），該信號是太低，在曝光時間產(chǎn)生可忽略不計的光毒性和光漂白區(qū)分。像素合并2×2和4×4的逐漸增大的信號電平，但在成本的空間分辨率（圖3（b）和圖3（c））。最亮的圖像是由分級的8×8個像素（圖3（d）），但存在激烈的分辨率損失。很重要的一點需要注意的是，圖像尺寸按比例減少在分級過程相結(jié)合的像素數(shù)增加。例如，在圖3中未像素合并（1×1）的圖像本來是1360×1024像素，而（2×2），（4×4），和（8×8）離散化圖像是680×512，340所述256，和170×128像素，分別。這些圖像已被縮小尺寸時，在圖中為了說明的目的。同樣地，數(shù)碼相機，具有512×512的顯示尺寸，會產(chǎn)生256×256，128×128，和64×64像素的圖像，當以類似的方式裝倉。

分級概念的一個關(guān)鍵點是，除了發(fā)生后的分選過程中，因此，即使幾個像素相結(jié)合，只有一個讀事件每股合并像素的讀出噪聲。相反，如果一個2×2的方塊的像素被計算數(shù)據(jù)收集后的平均值，其結(jié)果將是不如像素合并，因為由四個像素中的每一個的單獨的讀出的噪聲貢獻。因此，即使分級犧牲空間分辨率，它會導致到的信號噪聲比，一個特別有用的優(yōu)勢顯著增加時要求低光水平和較短的曝光時間上的光敏細胞進行實驗。在活細胞成像的關(guān)鍵參數(shù)通常能夠檢測到微弱的熒光信號，而不是解決這些問題的空間，以便提供圖像采集的力度和速度的增加抵消了損失分辨率的分級多。作為一種替代方法，以分級，許多高性能相機使研究者通過閱讀只有一個子數(shù)組或利息完整的CCD陣列，空間分辨率的同時，減少量的一個有用的機制來保存選定區(qū)域，以減少圖像采集時間時間細胞暴露于有害的照明。

為了克服傳統(tǒng)的高性能CCD相機的應用需求快速幀速率拍攝在非常低光水平的缺點，廠商都推出了一種創(chuàng)新的方法，以上的CCD讀出噪聲地板的微弱的信號放大。通過裝有一個片上的乘法增益寄存器，電子倍增的設備（EMCCDs）實現(xiàn)單光子的檢測靈敏度，典型的強化或電子轟擊CCD的低得多的成本和不損害傳統(tǒng)CCD結(jié)構(gòu)的量子效率和分辨率特性。EMCCDs的顯著特點是將一個專門的擴展串行寄存器在傳感器芯片上，生成乘法增益硅子結(jié)構(gòu)（參見圖4）內(nèi)通過的過程中，碰撞電離。高于的光子產(chǎn)生的電荷被讀出的噪聲，即使在高的幀速率，并且是適用于任何當前的CCD傳感器配置，包括背照式設備。

甲EMCCD相機系統(tǒng)的顯著優(yōu)點是，它們是相當便宜制造比加劇的CCD，由于CCD的結(jié)構(gòu)被直接并入到信號放大級。對于關(guān)鍵的活細胞與低強度的信號，如單分子成像中所遇到的，總的內(nèi)部反射，旋轉(zhuǎn)盤和掃頻場共聚焦顯微鏡，鈣或其它離子的通量測定，和時間分辨三維顯微鏡調(diào)查EMCCD提供其他傳感器，專為低信號電平的顯著優(yōu)勢。此外，與傳統(tǒng)的熒光成像技術(shù)的較高的信號電平的時，的EMCCD系統(tǒng)允許的極端敏感性較低的熒光基團的濃度和/或較低的功率電平，從激勵源的應用程序，由此減小了光毒性和光漂白的熒光探針。

顯微鏡的光學系統(tǒng)

顯微鏡針對活細胞成像的應用都必須配備一個高品質(zhì)的框架構(gòu)造堅固的復合材料或鋁和應穩(wěn)定牢固地安裝在無振動的平臺。光學表面的外觀以及組件箱（冷凝器，燈箱，物鏡轉(zhuǎn)盤等）應保持干凈的狀態(tài)和周圍環(huán)境的顯微鏡時，應無粉塵和低相對濕度。其中連續(xù)是必要的活細胞成像的常規(guī)程序是確保顯微鏡光學通路和隔膜對齊使用科勒照明的原則。實驗室房間的殼體顯微鏡的好處，以減少雜散光進入通過目鏡的顯微鏡或所述試樣腔室的水平的能力，以減少所有開銷照明。

電子數(shù)碼相機系統(tǒng)通常安裝到顯微鏡主體通過使用專門的適配器的一個或多個攝像頭端口。研究級顯微鏡通常配備多個端口，能夠同時連接多臺攝像機（見圖1）。顯微鏡，采用多種成像模式，使相機的優(yōu)化配置，為每個對比度增強技術(shù)，可以快速訪問在必要時，此功能特別有用。在顯微鏡主體內(nèi)，反射鏡，分光鏡，和棱鏡的級聯(lián)策略性定位，以反映圖像形成光波的相機的各種端口和目鏡。重要的是要注意，任何圖像采集期間發(fā)送到目鏡光這樣做在發(fā)送到照相機的光的犧牲，從而減少了信號 - 噪聲電平。因此，在顯微鏡配備的，口方向控制應調(diào)整到100％的光發(fā)送到相機端口，用于收購有限光子熒光圖像。

收集從檢體的最大的信號，并將其傳送到顯微鏡光學列車的物鏡的選擇是至關(guān)重要的。的光路中，作為反射鏡，分束器，投影透鏡，濾光鏡，和棱鏡等的元素數(shù)量過多會嚴重的降低信號被捕獲圖像中的噪聲電平必須保持在絕對最小值。在熒光成像，需要具有非常高的數(shù)值孔徑的物鏡是從檢體收集到的光的量最大化。數(shù)值孔徑，它定義了多少可以收集從一個單一的點光源的光的鏡頭，可以說是最重要的考慮因素，在選擇活細胞成像的物鏡。從低倍率（10倍）干物鏡油浸版本（通過100倍40倍）水和1.45 1.20 0.25，此值上刻的客觀桶和范圍。在數(shù)學術(shù)語中，數(shù)值孔徑被表示為：

數(shù)值孔徑（NA）=折射率（η）×鏡頭受光角（罪（θ））

因此，由前透鏡之間的介質(zhì)和能夠有助于最大衍射光線的角度（θ）的正弦乘以試樣的折射率（η）確定的光收集能力的客觀圖像形成。此外，生成的圖像的分辨率，由物鏡的數(shù)值孔徑是一個函數(shù)。根據(jù)瑞利判據(jù)（一個保守的估計），分辨率是等于一個常數(shù)（0.61）的照明的波長乘以除以由物鏡的數(shù)值孔徑。另外，數(shù)值孔徑定義的強度（亮度）的圖像，這是與數(shù)值孔徑的四次冪成正比，但只成反比的，與放大倍數(shù)的第二功率。因此，小的數(shù)值孔徑的增加可以產(chǎn)生顯著的改善信號。出于這個原因，活細胞的熒光成像通常需要最高的數(shù)值孔徑耦合到高折射率浸沒介質(zhì)（油或水）的物鏡。

如上所討論的，所述信號的亮度的物鏡放大倍率的平方成反比，所以，低倍率物鏡時，往往是有益的暗淡的樣品成像。例如，如果信號 - 噪聲比成為改變到類似的數(shù)值孔徑的60倍或40倍的物鏡將提供顯著的改善的亮度的數(shù)值孔徑1.4，用100倍的物鏡成像的標本中的限制因素。事實上，一個特定的熒光特性幾乎應該出現(xiàn)三次更明亮時，相對于100倍的物鏡（包括具有的數(shù)值孔徑為1.4）的具有60x的成像。所觀察到的強度也是一個函數(shù)變化的物鏡的傳輸質(zhì)量，它始終是值得考慮的放大率和binning在一起，以便評估一個特定的實驗中所需的最終倍率。

對于成像乘法標記的固定細胞（和在某些情況下，活細胞），在整個可見光光譜（范圍從400到700納米;稱為復消色差）良好地校正色差，具有平坦的成像平面（稱為平場物鏡或平光）被認為是理想的。不幸的是，復消色差和平場復消色差的物鏡，以及那些，用來捕捉更廣闊的視野，不可避免地含有多個光學元件（透鏡）的比不太精確的物鏡（消色差透鏡和熒光）。高度的校正使這些物鏡，用于透射光的技術(shù)，包括以最小的工件的相對比度和DIC。的結(jié)果，但是，光吞吐量犧牲，以獲得最佳的光學矯正，因此，有固定細胞成像的影響不大，但往往是反效果的活細胞成像。不足之處是最好的證明的平場復消色差物鏡40倍的物鏡有一個高數(shù)值孔徑為1.4，理論上應該約6倍的亮度比一個類似的100倍的物鏡，是在實踐中只有約4倍，明亮的。無論如何，40x和60x的物鏡仍然提供了明亮的圖像可以實現(xiàn)光學分辨率的限制。

圖5中示出的數(shù)值孔徑的分辨率和圖像的亮度方面的重要性的一個例子的原理。的標本是文化附著的非洲綠猴腎上皮細胞（CV-1線）的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染增強型綠色熒光融合蛋白的線粒體定位的核苷酸序列，細胞色素C氧化酶亞基第八。的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的哺乳動物宿主的轉(zhuǎn)錄和翻譯后，線粒體定位信號是負責運輸和分配的熒光蛋白嵌合體整個蜂窩線粒體網(wǎng)絡。管狀線粒體，隨后可應用熒光顯微鏡。

在圖5中，相同視野，使用具有相同的光學校正（平場熒光）和數(shù)值孔徑（1.3）的物鏡成像，但放大倍率從40倍到100倍不等。雖然利用在圖5中收集的圖像的像素和檢測器的條件的數(shù)目是相同的，線粒體最亮時，通過40倍的物鏡（圖5（a）;請注意，圖像已被調(diào)整到一個共同的的大?。┏上?。與此相反，更高的放大倍率60倍和100倍的物鏡（圖5（b）和圖5（c）中，分別）產(chǎn)生逐漸變暗的圖像，用100倍的圖像被幾乎不可見。這一物鏡仍然可以用作圖像試樣，但檢測器的增益，必須顯著增加，導致的信號 - 噪聲比和通常次于圖像的劣化。請注意，由于在相同的數(shù)值孔徑值的物鏡的分辨能力（圖5（d）至圖5（f））是可比。

從圖5中的數(shù)據(jù)，將收集到的主要概念之一是為了避免過度放大時，選擇物鏡為活細胞成像熒光蛋白（和其它熒光基團，對這一問題）。簡單地增加了數(shù)字放大（變焦），在激光共聚焦顯微鏡圖像采集，圖像大小相當于100倍鏡頭（圖5（D）和5（e））使用40x或60x的客觀結(jié)果。這兩個物鏡的分辨率是一樣的，因為他們有相同的數(shù)值孔徑。不應該采取的觀點相對次要的放大表明，使用60倍或100倍的物鏡是不利于。事實上，選擇的高倍率的物鏡通常是必要的成像時非常小的物體，如過氧化物酶體或分泌顆粒，使用廣角鏡。由于相對于檢測器的尺寸的圖像尺寸起著重要的作用，在確定空間采樣頻率，最佳倍率確定的參數(shù)的數(shù)字照相機系統(tǒng)（CCD像素尺寸和中間倍率）。因此，最好的選擇的物鏡通常依賴于檢測儀器的光學配置，除了特定的實驗的具體要求。

在的情況下的信號 - 噪聲比的分辨率更為關(guān)鍵，它常常是一種更好的選擇，利用物鏡下校正（更少的光學元件），具有顯著較高的光吞吐量。時，應注意也可用于通過包含顯著降低光透射的光學元件，如在相襯物鏡的振幅減小板的物鏡成像。此級別的光減少很少是傳輸模式中的一個問題，但可以大幅降低的信號電平（由15％至20％），在熒光成像。出于這個原因，相物鏡不應該被用于活細胞成像的低豐度的探頭除非實驗協(xié)議要求的相襯和熒光圖像的疊加。類似地，當組合使用熒光和DIC的圖像正在收集，偏振光分析儀（其中約30％，降低了信號）通常是在共用的光路定位物鏡下方的立即和獲取熒光圖像之前，應除去。

顯微鏡光學火車存在的任何缺陷將影響在最終圖像中的信號噪聲比。在活細胞成像與高數(shù)值孔徑物鏡，球面像差是最常見的神器，必須加以克服。此像差產(chǎn)生從洗澡的細胞（通常的折射率為1.33的水溶液）和客觀浸沒介質(zhì)的折射率的介質(zhì)之間的不匹配。球面像差通常本身表現(xiàn)為不均勻散布在焦點沿著光軸的圖像的一個點，使得顯著伸長和扭曲。由于該信號被分布在一個更大的體積，其像差的存在下，信號 - 噪聲比減少。此問題是更為嚴重的成像時比它是與蓋玻片上的貼壁細胞（通常只有幾微米厚），并可以通過使用水的浸沒透鏡是更密切地相匹配的折射率，在很大程度上消除了深成厚組織培養(yǎng)基中。作為一種替代方法，浸沒介質(zhì)的折射率或蓋玻片的厚度可以調(diào)整。重要的是要注意，折射率隨溫度的變化，因此，液浸介質(zhì)的最優(yōu)組合，和蓋玻片厚度會有所不同攝氏室溫和37度之間。較新的浸漬用校正鋌物鏡可以用來對抗由溫度引起的折射率的波動。

圖6給出的顯微鏡的光學系統(tǒng)（面板（*））和檢測器（數(shù)碼相機，圖（b）），在執(zhí)行活細胞調(diào)查的是顯著的局限性。的檢體是由一個單一的間期細胞核的粘合大鼠袋鼠腎上皮細胞（PTK2線）表達增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的稠合的的蛋白H2B序列（其定位在細胞核中），并與外延懷德菲爾德熒光成像照明。下部的右側(cè)角面板（一）中的光學系統(tǒng)，并在較低的左上角的圖（b）的數(shù)字照相機系統(tǒng)的最高分辨率的圖像。在活細胞的顯微鏡，光學系統(tǒng)確定供對比度生成，以及規(guī)定的物理分辨率的限制，它是由物鏡的數(shù)值孔徑和波長的照明設置的光的數(shù)量。作為照明強度的增加（運行在面板（*）從頂部到底部），光子計數(shù)噪聲變得不那么明顯，圖像質(zhì)量顯著提高。同樣，作為增加的光學分辨率（左面板（*）中的右邊），更小的細節(jié)的細胞核變得更加顯而易見。

數(shù)字照相機系統(tǒng)捕獲從顯微鏡和數(shù)據(jù)根據(jù)離散的光水平和空間分辨率的元素（圖（b），圖6）的樣品的光信息。像素尺寸的增加（左右圖（b）），眾多功能的小細節(jié)變得模糊和圖像獲取一個塊狀的，幾乎不可見的外觀（右下角的角落里圖（b））。降低利用捕獲和顯示的圖像（在圖（b）中的頂部的底部）的灰度級的數(shù)目減少的陰影，只留下的功能具有非常高的對比度（在圖（b）中的頂行）。請注意，這兩個因素共同作用提供信息。再次，在活細胞成像實驗，收集的信息應該是成正比的要求的調(diào)查。

各種濾光鏡和反射鏡設計的活細胞成像的顯微鏡直接和微調(diào)照明和發(fā)光波長的檔案，因為它從光源通過顯微鏡（標本），然后到檢測器。與對比度增強的光學系統(tǒng)在傳輸模式中，改性光組件或偏振片和棱鏡（DIC）或冷凝器環(huán)空中和相位環(huán)（相襯和Hoffman調(diào)制對比度）。由于光在顯微鏡光學火車明場，DIC，和相襯的整體吞吐量遠遠高于用熒光，通常是必要的，以增加信號噪聲很小的修改，當在這些模式中的成像。主要考慮的是過濾的鎢鹵素燈照明，以消除光毒性紫外線和紅外線的波長，才損壞試樣。阻止紅外光，是必要的，以避免熱損傷的細胞，以減少復雜的信號 - 噪聲與紅外線敏感的相機系統(tǒng)的背景水平。紫外線是更少的用透射光燈的關(guān)注，但使用的綠色或紅色的干涉濾光器，可以容易地控制試樣的波長達到。兩個紅外線和可見光濾光鏡將顯著減少光的水平，并可能需要增加曝光和增益設置的檢測器系統(tǒng)上，以保持信號 - 噪聲。

在熒光成像，干涉濾光片和二色性反射鏡的組合來選擇合適的波長頻帶的光，用于激勵和收集從熒光團標記試樣排放。在熒光顯微鏡中，相對低光照水平相比，傳輸模式時，呈現(xiàn)為實現(xiàn)足夠的信號 - 噪聲水平的關(guān)鍵的選擇的濾光鏡。在大多數(shù)情況下，尤其是在信號泄放通過關(guān)注的問題是由于重疊的熒光團發(fā)射的檔案，帶通激發(fā)和發(fā)射（阻擋層）濾光鏡的應用是必需的。通常情況下，在這些濾光鏡中的固有的窄的光譜窗口進一步限制通過的光量通過顯微鏡觀察，挑戰(zhàn)研究者用于獲得良好的圖像，來選擇最佳帶寬。

各種各樣的具體的帶通濾光鏡和二色鏡組合的顯微鏡制造商和濾光鏡售后光學公司。對于最佳的信號與噪聲的，選擇的濾光鏡的組合為活細胞成像應密切匹配的實驗中所用的熒光光譜檔案。例如，使用一個標準的熒光素（FITC）濾光鏡集的多色標記的應用程序中的圖像細胞表達本身會不必要地犧牲一些YFP的熒光黃色熒光蛋白（YFP），否則將改善的信號-噪聲（設計參見圖7（a））。在這種情況下，匹配濾光鏡與適當寬的帶通激發(fā)YFP的吸收和發(fā)射公司產(chǎn)生顯著更高的信號耦合到一個長通發(fā)射濾光片。

優(yōu)化熒光濾光器的組合，以獲得盡可能高的信號電平的一個例子，提出了在圖7中的兩個常用的熒光蛋白衍生物。頂部面板（圖7（a）和圖7（b））示出的吸收和發(fā)射光譜金星，位點定向誘變產(chǎn)物YFP，疊加超過FITC標記的濾光鏡組（圖7的（a）），以及一個專門的寬帶組合旨在最大限度地采集的信號，在一般情況下，從黃色熒光蛋白（圖7（b））。雖然發(fā)射濾光鏡與問候到檢測器發(fā)送的信號的電平相媲美，金星的吸收光譜，和異硫氰酸熒光素的激發(fā)濾光片帶通區(qū)域是顯著小于寬帶YFP集觀察之間重疊，導致低效的激勵和減少信號。同樣，TRITC濾光器組合（圖圖7（c））不激發(fā)mCherry熒光蛋白的效率作為得克薩斯紅集（圖圖7（d））。此外，在得克薩斯紅組合的發(fā)射濾光鏡的更寬的帶寬通過更多的信號的檢測器。關(guān)于選定的濾光鏡組合應仔細檢查每個活細胞成像實驗中使用的熒光激發(fā)和發(fā)射，以確保最高的效率。

除了設計單個熒光圖像的標準濾光鏡的組合，多頻帶集現(xiàn)在隨時提供給能夠同時與兩個或更多的熒光探針標記的試樣的照明和探測。其他因素時，必須考慮微調(diào)顯微鏡的光學列車是中性密度濾鏡的戰(zhàn)略定位，激發(fā)照度水平（活細胞熒光成像的關(guān)鍵），以及紫外線和紅外線濾光鏡，以減少抵消或消除樣品光毒性。這些濾光鏡通常置于之間的電弧放電（或激光）的照明源和顯微鏡的輸入光端口，并且可以很容易地互換，以優(yōu)化光的吞吐量。通過顯微鏡的光通過的強度和數(shù)值孔徑也可以通過仔細調(diào)整的冷凝器或落射照明光圈和視場光闌調(diào)節(jié)。

光學分辨率探測器的幾何形狀相匹配

只要有足夠的采樣由檢測器系統(tǒng)的光學圖象，在顯微鏡下拍攝到的圖像的空間分辨率通常被定義的光學系統(tǒng)的分辨率。由于從每個都具有一個固定的大小的光電二極管的陣列構(gòu)成的CCD探測器，幾何形狀的各個像素可以限制最終的分辨率的圖像。為了實現(xiàn)大的分辨能力的顯微鏡，檢測器的尺寸應符合每個艾里斑單元為2.5?3像素的奈奎斯特采樣準則。作為一個例子，250納米的光學分辨率極限，在最終圖像中的像素的大小應是約80至100納米。在活細胞成像，信號噪聲比光學分辨率往往是更重要的，最有用的限制收集圖像沒有明顯的退化是每艾里斑的2個像素。減少每艾里單元的像素的數(shù)量增加的亮度的圖像，并使得能夠使用較大的CCD光電二極管，可以積累更多的光電子。

圖8所示的（a）是通常用在投影到CCD像素陣列的表面的活細胞成像的高數(shù)值孔徑的物鏡的艾里磁盤從圖像。陣列中的每個像素的尺寸為6微米。的100倍的物鏡，用1.4的數(shù)值孔徑，將圖像投影到CCD表面直徑是20微米（見表1），從而容易地實現(xiàn)奈奎斯特采樣大小（3.3像素每個艾里單元）。在本次抽查頻率，留有足夠的余量，幾乎滿足奈奎斯特準則，甚至用2×2像素組合。相比之下，60x的物鏡（也1.4數(shù)值孔徑）的投影圖像是12微米的直徑，僅低于奈奎斯特限制的下邊界。另外，即使減小數(shù)值孔徑為1.3，在40倍的物鏡產(chǎn)生一個8.4微米的圖像，將需要一個放大鏡照相機適配器符合奈奎斯特分辨率標準。光電二極管陣列具有更大或更小的像素尺寸相匹配的光學分辨率，沒有中間放大的顯微鏡，或用專門的CCD適配器，其中包含合適的鏡頭系統(tǒng)，可以輕松地修改。

甲的2×2像素binning示意圖在圖8（b）為一個包含16個像素的陣列。的光電子在曝光期間積累后，相機讀出電路執(zhí)行兩個連續(xù)的4個象素，每個象素的平行移動。隨后，兩個串行寄存器位移的1個像素的地方收集的4個像素（2×2像素合并）到它們的電壓的輸出節(jié)點，其中讀出放大器的光電子。在類似的方式中，4×4像素合并（圖中未示出）將在整個16個像素陣列中的內(nèi)容轉(zhuǎn)移到輸出節(jié)點，在讀出之前，顯著增加了，同時減少了讀出噪聲的信號。正如前面所討論的，像素binning是一個極好的方法來檢索弱信號時，檢查在低表達水平降低毒性工件所需標記的熒光蛋白的活體標本。

在實踐中，理想的像素大小在最終圖像中具有的數(shù)值孔徑為1.4的一個物鏡是在100納米和120納米之間。這個數(shù)字翻譯成相應的物理尺寸的CCD光電二極管，需要考慮的放大倍數(shù)為物鏡。例如，為了實現(xiàn)為60x的物鏡（1.4數(shù)值孔徑）的完整的光學分辨率的檢測器必須具有一個光電二極管6微米或更小的大小的（確定的倍率和分辨率的乘積）。然而，對于相同的數(shù)值孔徑的100倍的物鏡，最佳的光電二極管的大小被增加至10微米。因此，顯而易見的是，僅一個特定的CCD攝像機的數(shù)字分辨率匹配的顯微鏡的光學分辨率，當相機被適當?shù)芈?lián)接到適當?shù)?/span>物鏡。交配的CCD照相機，具有10微米的光電二極管，以100倍的物鏡，將導致在一個最終的像素大小的圖像（100納米）。相同的相機時，會產(chǎn)生167納米的像素用一個60倍的物鏡，這限制了在一定程度上記錄的圖像分辨率。與此相反，與6微米的光電二極管的CCD將被完全匹配到60x的物鏡，但會產(chǎn)生過采樣的圖像時，顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)換器是旋轉(zhuǎn)插入的100倍的物鏡。過采樣在這種方式中，將顯著地降低圖像的亮度的同時，不能提高分辨率。

從前面的討論，它似乎唯一相匹配的檢測器的像素分辨率的顯微鏡的光學系統(tǒng)的理想的解決方案是使用針對每個物鏡的不同的攝像機。在實踐中，很明顯，這種策略是不現(xiàn)實的，必須找到一個妥協(xié)的單相機系統(tǒng)優(yōu)化工具。在某些情況下，通過安裝的客觀時間倍率的顯微鏡和照相機之間的耦合器的分辨率的問題，可以規(guī)避。例如，一個0.6倍的耦合適配器將降低投影圖像的倍率從100倍的物鏡是相同的一個60x的物鏡。各種各樣的耦合器提供的售后分銷商增加或減少的CCD光電二極管陣列平面的投影放大。轉(zhuǎn)乘半信半疑上述建議的數(shù)字CCD攝像機方面，重要的是要注意，雖然這些器件可以相對容易地從顯微鏡，除去它是優(yōu)選離開將相機安裝在顯微鏡的端口，以防止灰塵和碎屑進入身體的顯微鏡和從附著在攝像機圖像的傳感器窗口（靜電促進的工件）。清潔傳感器面板窗口是一個異常困難的任務，特別是當物鏡是完全刪除的每一個粒子的灰塵。

像素大小的要求比對顯微鏡的光學分辨率

表1

目前的高性能數(shù)碼相機系統(tǒng)設計的熒光顯微鏡光電二極管尺寸從5至16微米，具有片上分級。如上所討論的，像素合并功能使從幾個相鄰的光電二極管的電荷被合并成一個較大的單位，有效地增加了的像素的大小。在6至8微米的光電二極管的尺寸范圍的攝像機，充分顯微鏡光學分辨率通?？梢员黄ヅ涫褂?/span>60x的物鏡沒有像素合并，而與100倍的物鏡，以提高圖像的亮度可以利用像素合并成一個2×2陣列的光電二極管。除了利用匹配的光學系統(tǒng)分辨率的CCD，使用更高的傳輸60x的物鏡，這種方法允許更明亮的圖像時，使用100倍的物鏡結(jié)合分級（2×2像素組合提高了靈敏度4倍）。其結(jié)果是，用100倍的物鏡記錄圖像，在紙槽2是大約兩倍與60x的物鏡沒有像素合并作為記錄的圖像的亮（及同等或更好的分辨率）。在額外的靈敏度的情況下，需要或必要時，可以60倍的物鏡分級2×2的亮度增加了四倍并發(fā)損失通常是可以接受的決議，對于大多數(shù)活細胞成像調(diào)查。

在一些應用中，如那些需要一個大的細胞種群的同時監(jiān)測，捕獲的較大部分的視野是更重要的空間分辨率。該矩形的CCD圖像傳感器，在數(shù)碼相機中，沒有中間倍率不捕獲整個視場的通過顯微鏡目鏡作為可視化的，而是它被限制為30％和80％之間的范圍內(nèi)，取決于芯片尺寸。是必需的，如果一個較大的視野耦合適配器（如上所述），可以采用時間倍率。在許多情況下，一個0.6倍的中繼透鏡將投影的圖像的大小，其值接近在目鏡看到的視圖，但在一定的成本在分辨率。或者，為了保持分辨率，相鄰的字段的多個圖像可以聚集在高放大倍率使用x - ?機動掃描階段和隨后縫合在一起成一個較大的圖像使用采集后處理軟件。

在光學顯微鏡的最大的分辨能力，實現(xiàn)與近紫外光，最短的有效成像波長。其次是藍色，綠色，最后變?yōu)榧t色光的能力，以解決樣本的詳細近紫外光。在大多數(shù)情況下，顯微鏡使用廣譜白色的光所產(chǎn)生的鎢鹵燈泡照亮標本，但在活細胞成像的照明的頻譜通常僅限于通過窄帶干涉濾光片的應用。在可見光光譜的中心在約550納米，主波長為綠色光（人眼最敏感的綠色光）。它是這樣的波長，被用來計算分辨率值示于表1，所以這些值將不同當利用較高或較低的波長的光時，。的數(shù)值孔徑值也是重要的，更高的數(shù)值孔徑也將產(chǎn)生更高的分辨率，可以觀察到的物鏡表中的類似的倍率。

結(jié)論

也許最關(guān)鍵的活細胞成像方面實現(xiàn)最佳平衡信號強度低倍率的青睞，分辨率（放大倍率越高，所青睞），和細胞活力的放大倍率，同時在試驗過程中。調(diào)查員必須密切注意，以配合最終的像素大小的探測器，利用盡可能少的鏡片的光學放大倍率。光學耦合器，具有各種各樣的中間放大系數(shù)是市售匹配兩個光限制和高分辨率的應用程序的特定的客觀要求（倍率和數(shù)值孔徑）。Nyquist分辨率標準時，應嚴格選擇的物鏡放大倍率。每個像素應該對應于不超過一半所需的分辨率的限制，由于在顯微鏡的衍射極限，此距離應不小于50納米的大多數(shù)應用程序。

干部的活細胞成像顯微鏡的物鏡通常采用的標準是10倍和40倍（干），以及40X，60X和100X的油或水浸泡版本。經(jīng)濟型干式低倍率的鏡頭主要用于標本的初步掃描，以找到感興趣的領(lǐng)域和不需要的高光校正因素。然而，浸沒透鏡應設有高的數(shù)值孔徑（1.3至1.45的油和水為1.2）和高的光透射效率。由于圖像通常聚集的中心附近的視野，高度校正的物鏡，這些物鏡通常產(chǎn)生一個平面場提供沒有可檢測到的好處是明顯更昂貴的和更少的光效率比少許校正物鏡。用于熒光成像物鏡應檢查的點擴散函數(shù)使用熒光微球的質(zhì)量。

冷卻單色CCD相機是最好的選擇，對于大多數(shù)成像應用領(lǐng)域涉及文化的活細胞，無論是否落射熒光還是透射光對比度增強（DIC和相襯）是主要的收購模式。在選擇相機時，考慮的重要參數(shù)，包括量子效率，噪音水平（暗電流和讀出），像素大?。ㄒ约跋嚓P(guān)的全井產(chǎn)能），并掃描頻率。為了盡量減少水平的激發(fā)光，照射在試樣上，相機應該盡可能敏感，這通常意味著量子效率高，噪聲低，大的像素尺寸，和慢的掃描速率。靈敏度因此，必須對所要求的分辨率（青睞大量的更小的像素）和物鏡成像率（由較高掃描頻率的青睞）平衡。

慢掃描CCD相機一般都在他們的幀速率的限制，此外，樣本，除非有非常明亮的熒光，信號 - 噪聲比是差時的曝光時間短。這限制了使用這些攝像機系統(tǒng)的高速成像應用程序（高達每秒30幀），和挫敗嘗試聚焦樣本。應努力以避免漂白和光毒性，可能會損害細胞的活力和亮度的工件，當找到一個合適的標本和對焦的攝像頭。在這方面，應選擇相機功能無快門，幀傳輸或隔行掃描CCD傳感器，這是能夠提供除了慢掃描數(shù)字信號的圖像在視頻速率的連續(xù)流。極端低光照條件下，熒光探針顯示有限的豐度或低的量子產(chǎn)率，再加上捕捉高速運動的要求，有必要強化或電子倍增CCD相機系統(tǒng)使用。