奧林巴斯顯微鏡：熒光顯微鏡優(yōu)化和故障排除

熒光顯微鏡的一個(gè)重要特點(diǎn)是它能夠探測(cè)到熒光的對(duì)象，有時(shí)隱隱可見(jiàn)，甚至非常明亮與黑暗的背景（通常是黑色）。為了優(yōu)化此功能，使用的引物在該部分將要討論的原則，圖像的亮度和分辨率必須最大化。

圖像亮度 - 優(yōu)化的圖像的亮度的最重要的方面之一是，以確保在每個(gè)連接到試樣的發(fā)色基團(tuán)的適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，樣品被提供用于激勵(lì)具有足夠的光能量。同樣重要的是，選擇適當(dāng)?shù)?/span>擋板濾光鏡，向觀察管或攝像管發(fā)射的熒光的量最大化。我們已經(jīng)組建了一個(gè)表列出的熒光激發(fā)和發(fā)射數(shù)據(jù)，這將有助于實(shí)現(xiàn)這一物鏡。高能量的光源，如汞和氙氣的燃燒器，將提供大量的激發(fā)能在非常窄的范圍的近紫外和可見(jiàn)光。當(dāng)使用這些光源耦合到同時(shí)阻擋那些是不希望的，能夠發(fā)送所選波長(zhǎng)的激發(fā)濾光鏡，適當(dāng)?shù)剡x擇，然后將滿足用于激發(fā)的最佳標(biāo)準(zhǔn)。

擋板濾光鏡，防止不需要的波長(zhǎng)進(jìn)入觀察管的選擇是一個(gè)主要問(wèn)題。激發(fā)的總能量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于發(fā)射的能量，因此，重要的是要選擇一個(gè)有效的擋板濾光鏡，將阻止不必要的波長(zhǎng)熒光發(fā)射，同時(shí)允許從樣品通過(guò)。為熒光選擇的物鏡必須能夠有效地透射光，在近紫外區(qū)域和在整個(gè)可見(jiàn)光譜。

在低發(fā)射的光水平的圖，在熒光顯微鏡中的作用的物鏡是非常重要的，因?yàn)樗鞘占瘉?lái)自樣本的光的物鏡的功能。物鏡所接受的光的錐角是由數(shù)值孔徑（NA）為物鏡來(lái)確定，如在圖1中示出。在透射光中的熒光顯微鏡，到達(dá)眼睛或其它檢測(cè)器的光的強(qiáng)度成正比作為物鏡和聚光鏡的總放大倍數(shù)的平方成反比的數(shù)值孔徑的平方。

另一方面，在反射光熒光的圖像的強(qiáng)度變化直接作為使用中的數(shù)值孔徑的四次冪物鏡，以及數(shù)值的總放大倍數(shù)的平方成反比：

I = NA4 / Mag2 

這種差異來(lái)作為物鏡的最初功能作為一個(gè)聚光鏡，用于在樣本上的光聚光，然后作為用于圖像形成的通常的光采集的結(jié)果。其意義是顯而易見(jiàn)的：高數(shù)值孔徑物鏡會(huì)產(chǎn)生高得多的強(qiáng)度比相同的放大倍數(shù)較低的數(shù)值孔徑的物鏡圖像。例如，其他的事情都是平等的，40倍物鏡的NA為1.0將帶來(lái)超過(guò)5倍的亮度比40倍物鏡的數(shù)值孔徑為0.65的圖像。進(jìn)一步的含義是，如果可能的話，低倍率的視覺(jué)目鏡（如8倍的放大倍率）也將增加圖像的亮度相比，比較常用的10X觀察目鏡。此外，在反射光中的熒光，激發(fā)光被濃縮的物鏡（在其作為聚光鏡的功能），僅在被觀察的區(qū)域。其結(jié)果的激勵(lì)光的強(qiáng)度遠(yuǎn)高于在透射光中的暗視野熒光，其中被激發(fā)的面積不改變作為物鏡被改變。此外，在暗視野，物鏡的數(shù)值孔徑必須被減小到低于保存的視場(chǎng)的黑暗的聚光鏡。

除了是一個(gè)重要的考慮因素的數(shù)值孔徑，這是可取的有最高質(zhì)量的色差校正的物鏡，因?yàn)榫劢乖谕黄矫嫔系母鞣N顏色，將產(chǎn)生更清晰的圖像。另外，更好的球面校正，更清晰的圖像。因此中，物鏡的選擇是平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡或平場(chǎng)熒光物鏡。的設(shè)計(jì)應(yīng)使這些透鏡元件及其水泥本身不會(huì)自動(dòng)熒光時(shí)，低于400納米的波長(zhǎng)（光在近紫外）光照射。

在可能的情況下，應(yīng)采用油浸物鏡，從載玻片和蓋玻片表面反射所造成的光損失減少到最小。現(xiàn)代顯微鏡制造商努力為客戶提供光學(xué)元件是完全免費(fèi)的自體熒光污染物，但是這方面也應(yīng)考慮自體熒光將減少通過(guò)增加背景亮度對(duì)比樣品。

圖像分辨率 - 皇家顯微學(xué)會(huì)（RMS）標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片厚度如果0.17毫米。中的統(tǒng)計(jì)抽樣，由于在制造過(guò)程中的波動(dòng)的蓋玻片這個(gè)號(hào)碼（通常0.01毫米0.03毫米）的有一種輕微的變化程度。高數(shù)值孔徑“干”的物鏡是最容易受到這些變化，許多人提供校正衣領(lǐng)，讓顯微鏡微調(diào)物鏡校正玻璃蓋厚度。這是非常重要的，購(gòu)買高度精確的蓋玻片，確保物鏡校正衣領(lǐng)優(yōu)化調(diào)整。此外，一些廠商提供專業(yè)化的物鏡，包含一個(gè)內(nèi)部的虹膜式光圈與100X復(fù)消色差透鏡奧林巴斯物鏡如圖2所示。應(yīng)盡量減少眩光的這個(gè)可變光闌（圖2）進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，如果配備的話，在使用的物鏡。

當(dāng)使用油浸物鏡，吸干鏡頭前用紙巾除去油使用后，確保清潔定期用適當(dāng)?shù)娜軇ㄍǔ＜s一個(gè)月一次就足夠了）。多余的油留在浸泡物鏡可以拿起空氣中的灰塵，并降低圖像質(zhì)量和分辨率。此外，還要確保浸油，無(wú)PCB，有一個(gè)非常低的或不存在的電平的自體熒光，被施加到?jīng)]有形成氣泡的物鏡蓋玻片界面。

顯微鏡的光路中應(yīng)仔細(xì)調(diào)整，以確保所有組件都已正確放置并執(zhí)行，它們被設(shè)計(jì)。應(yīng)正確對(duì)準(zhǔn)光源的電弧光源為我們的討論中所描述的熒光顯微鏡。

清潔光學(xué)元件 - 在熒光顯微鏡（和所有其他形式的顯微鏡）的第一條規(guī)則是要保持完全免費(fèi)的灰塵，污垢，油，溶劑和任何其他污染物的光學(xué)元件。顯微鏡時(shí)，應(yīng)保持在低振動(dòng)無(wú)煙房，是盡可能干凈，并具有循環(huán)空氣的干擾最小。使用防塵蓋顯微鏡在不使用時(shí)，保持在氣密容器內(nèi)的所有配件。避免使用腐蝕性溶劑來(lái)清潔顯微鏡的任何部分，并且只能使用稀釋過(guò)的肥皂水清洗非光學(xué)表面。物鏡應(yīng)保持清潔使用下面的提示：

?切勿拖動(dòng)任何具有高度的壓力，包括鏡頭紙?jiān)阽R頭表面，以避免表面上的可能性非常細(xì)微的劃痕引入。
?用溶劑設(shè)計(jì)的光學(xué)表面，或在緊急情況下，無(wú)水乙醇清潔鏡頭。避免其他溶劑，因?yàn)樗鼈兛赡芘c光學(xué)鍍膜玻璃上反應(yīng)。
?灰塵在鏡頭表面前壓縮氣體用溶劑清洗，以去除松散顆粒。
?浸泡棉條鏡頭清潔劑或酒精輕輕擦拭它在鏡頭轉(zhuǎn)動(dòng)棉簽頭幾次，每次傳球前。用鏡頭紙吸干多余的溶劑，并讓鏡頭徹底晾干。重復(fù)此過(guò)程。

油浸鏡頭可以用溶劑清洗，如上面所述。切勿使用油與物鏡擬用于干燥，因?yàn)榍鍧嵏稍锏?/span>物鏡困難得多一個(gè)專為油。

進(jìn)一步提示和故障排除 - 在理想情況下，所有應(yīng)做顯微鏡在黑暗的房間，但熒光顯微鏡，這一點(diǎn)尤其重要。人類的眼睛有問(wèn)題，迅速調(diào)整到天黑，這將是很難辨別一個(gè)非常暗淡的熒光標(biāo)本后立即變黑房間。通過(guò)阻斷激發(fā)光時(shí)，不觀看或攝影標(biāo)本，避免過(guò)度漂白的標(biāo)本。盡量減少自體熒光去除多余的熒光在安裝前徹底清洗試樣。對(duì)于其他方面的一般問(wèn)題的解決和故障排除，請(qǐng)參閱下面的表1。

表 1

顯微攝影的熒光標(biāo)本，提出了一些獨(dú)特的挑戰(zhàn)，是無(wú)與倫比的光學(xué)顯微鏡。雖然相機(jī)系統(tǒng)參數(shù)保持不變，必須支付更多的關(guān)注，暴露的細(xì)節(jié)和這些文物互惠故障發(fā)生的結(jié)果非常長(zhǎng)的曝光時(shí)間。有許多好書(shū)的主題，有興趣的讀者被稱為我們的參考書(shū)目和網(wǎng)絡(luò)資源的進(jìn)一步信息部分。