尼康顯微鏡：完美的對焦系統(tǒng)（PFS）
目前在熒光蛋白技術(shù)革命驅(qū)動廣泛的相關(guān)聯(lián)的方法，包括使用的活細(xì)胞在熒光顯微鏡的各種攝像模式。在過去的幾年中，由于豐富的動態(tài)信息，它可以提供有關(guān)細(xì)胞功能的基本性質(zhì)，在許多細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗室的活細(xì)胞成像已經(jīng)成為一個必不可少的工具。也許最有趣的生物學(xué)問題，包括那些關(guān)于增長，分化，分裂和細(xì)胞凋亡的可視化在活細(xì)胞中，最終將被回答了長期的顯微鏡使用時間推移成像技術(shù)的調(diào)查?；罴?xì)胞成像，其中的細(xì)胞必須保持在一個健康的環(huán)境，在顯微鏡舞臺上，提出了一系列的挑戰(zhàn)，以確保細(xì)胞維持生命，在整個試驗過程中關(guān)注的焦點(diǎn)。本發(fā)明提供的環(huán)境條件是理想的，最顯著的陷阱成像活細(xì)胞是固有的焦點(diǎn)漂移，經(jīng)常發(fā)生由于熱梯度，振動，機(jī)械不穩(wěn)定性，以及一些其他因素。
通過創(chuàng)建一個唯一的硬件解決方案，尼康已經(jīng)解決了這個問題的焦點(diǎn)漂移，被稱為完美的對焦系統(tǒng)（PFS），其目的是打擊軸向重點(diǎn)長期影像學(xué)檢查過程中實(shí)時波動。廣泛的干，水和油浸物鏡，從4倍到100倍具有不同的數(shù)值孔徑和工作距離，可以使用TIE-PFS倒置顯微鏡聚焦補(bǔ)償。被容納在一個專門的的物鏡轉(zhuǎn)盤單元（圖1），并不需要額外的的無邊空間和使主顯微鏡光學(xué)火車保持專用于成像的近紅外870-納米LED和CCD行傳感器，利用由PFS。其中最先進(jìn)的功能的尼康PFS為5毫秒（200赫茲）的采樣率，這是獨(dú)立的顯微鏡和相機(jī)控制軟件，并大大快于其他系統(tǒng)的的蓋玻片接口到焦平面的利益都必須反復(fù)探討。利用長波長的LED，使鐵PFS使用了大量的各種熒光基團(tuán)發(fā)射的波長范圍在340和750納米之間。此外，PFS可用于幾乎所有的對比增強(qiáng)成像模式，包括明場，暗場，相襯，霍夫曼調(diào)制對比度，DIC，寬視場熒光，激光共聚焦，TIRFM，旋轉(zhuǎn)盤，和掃描線掃過場。
PFS的多功能性是顯而易見的，從范圍廣泛的熒光探針，可用于活細(xì)胞成像焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償。如上所討論的，在PFS單元的帶通干涉濾光器跨越寬的傳輸范圍中的340至750納米（見圖2;左紅色曲線），使應(yīng)用程序的所有公知的熒光蛋白質(zhì)（包括發(fā)射近紅外植物光素），量子點(diǎn)，和最流行的合成的熒光團(tuán)（范圍從Fura-2的Cy5標(biāo)記的Alexa Fluor700，并且最在ATTO染料）。該系統(tǒng)還采用了用于透射（透射光）的細(xì)胞培養(yǎng)的照明使用上面列出的傳統(tǒng)的對比度增強(qiáng)技術(shù)的紅外截止濾光器。通過除去從PFS單元內(nèi)部的紅外阻擋濾波器，它可以適合于用激光鑷子和激光俘獲應(yīng)用程序，以及作為一個部分的多光子激發(fā)光譜區(qū)域。濾波器的通帶為可見光和近紅外區(qū)域的PFS系統(tǒng)（紅色曲線;870納米LED）和其他的重點(diǎn)補(bǔ)償系統(tǒng)（藍(lán)色曲線約780納米LED），如圖2所示。請注意，在加油站的較長波長的LED能夠使用的熒光團(tuán)發(fā)射的波長處，在其他系統(tǒng)中的沖突的焦點(diǎn)檢測。廣泛的物鏡（超過50種）兼容的PFS單元包括油和水的浸泡，干許多不同的設(shè)計和修正的物鏡，相襯物鏡，有長工作距離的幾個可選的物鏡。
在除了加油站所提供的寬的熒光基團(tuán)的發(fā)光波長范圍，高的聚焦校正的采樣率是至關(guān)重要的實(shí)驗，需要在實(shí)時速度或更快的成像。許多市售的聚焦補(bǔ)償系統(tǒng)調(diào)整焦點(diǎn)之前觸發(fā)圖像捕獲軟件，這嚴(yán)重限制了可用的在收集連續(xù)圖像之間的最小時間間隔。例如，當(dāng)在5秒每幀的成像，大多數(shù)焦點(diǎn)漂移補(bǔ)償系統(tǒng)就足夠了。然而，一個系統(tǒng)，需要500毫秒的時間來采樣的聚焦?fàn)顟B(tài)將限制圖像采集速度幾乎是第二個（或更多），根據(jù)攝像機(jī)的積分時間。這將創(chuàng)建一個巨大的瓶頸，對于許多應(yīng)用程序在活細(xì)胞成像。通過解偶聯(lián)重點(diǎn)從圖像采集取樣，PFS連續(xù)的圖像采集速度范圍從幾毫秒到分鐘不中斷。事實(shí)上，捕捉速度是有限的一體化攝像機(jī)的時間，而不是集中位置采樣。連續(xù)采樣功能是非常有用的監(jiān)測實(shí)驗，在高速的幾個橫向切片位置（需要XY載物臺的翻譯），調(diào)查（如使用熒光蛋白的生物傳感器監(jiān)測鈣波感應(yīng)），要求迅速加入試劑的切片室在一個實(shí)驗的過程中，只有幾毫秒的持續(xù)期間。
完美的對焦系統(tǒng)剖析
關(guān)鍵的基本概念尼康PFS是一個合適的軸向（z）的參考平面，可以被用來建立一個確切的近端之間的關(guān)系的物鏡前透鏡元件的位置和感興趣的焦平面內(nèi)的切片，準(zhǔn)確地檢測。完成該任務(wù)使用的近紅外光（870納米），所產(chǎn)生的輔助的光學(xué)系統(tǒng)，和引入主顯微鏡光學(xué)列車通過二色鏡。在870納米的光，這不會干擾正常的透射光或熒光觀察，由物鏡聚焦到駐留之間的蓋玻片（折射率1.5）和周圍介質(zhì)的試驗片（折射率的折射率邊界,1.33-1 .38）時使用油浸泡的物鏡。水的折射率邊界作為參考平面，當(dāng)浸泡水或油的物鏡，但干物鏡使用空氣玻璃蓋玻片上面臨的物鏡前透鏡元件的相對側(cè)上的邊界。
在操作中，研究者專注于感興趣的平面內(nèi)的檢體（通常的生活，貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，在一個專門設(shè)計的成像室）和激活的PFS單元，然后投影到參考平面和所述近紅外線圖案定義了一個偏移量或軸向參考平面之間的距離和切片焦平面。 PFS的連續(xù)位置數(shù)據(jù)饋送回的電路控制的顯微鏡聚焦機(jī)構(gòu)保持在參考平面和成像焦點(diǎn)之間的精確關(guān)系。偏移的程度是由操作員控制，并且是由一個步進(jìn)電機(jī)（0.025微米的軸向分辨率）的PFS單元中保持恒定，不論獨(dú)立的垂直波動發(fā)生的檢體的位置或顯微鏡光學(xué)列車。線性編碼器的寄存器的位置坐標(biāo)的物鏡類型的一個函數(shù)的物鏡轉(zhuǎn)盤，并用來作為一個計量裝置，以確定位置的物鏡有關(guān)的參考平面。因此，物鏡轉(zhuǎn)換盤的軸向位置和焦點(diǎn)偏移量可以被注冊和存儲每個物鏡與線性編碼器的電子控制裝置。
尼康PFS單元被安置在六個物鏡機(jī)動定位之間的熒光過濾器設(shè)置炮塔和舞臺上倒模型Ti-E顯微鏡的物鏡轉(zhuǎn)換器。為系統(tǒng)的電子控制器被集成在該幀之內(nèi)，所以本機(jī)工作在獨(dú)立模式下，而不需要一個軟件接口到主機(jī)計算機(jī)。完美的對焦，使用杠桿的住房擺動二色鏡流入或流出的主要眼鏡直通車在平行光區(qū)域的波下的物鏡，可以從事或脫離。公司內(nèi)的PFS單元是一個單獨(dú)的光學(xué)系統(tǒng)，包含偏移的透鏡，光束成形光學(xué)元件，近紅外870納米的光的發(fā)光二極管，和一個線CCD探測器。為LED的光源和檢測器的單獨(dú)的光學(xué)列車在半透半反鏡的中央部的單元相交，并從主使用可切換的主要的二色鏡的光學(xué)系統(tǒng)的近紅外光被引導(dǎo)和檢索。的PFS的一個獨(dú)特的特點(diǎn)是，形成的圖像和聚焦檢測系統(tǒng)共享相同的光學(xué)火車的一部分，但可以彼此獨(dú)立地運(yùn)行沒有在它們的光譜的組合物的差異所造成的干擾。
示于圖3是一個示意圖，示出在主（成像成形;黃色光線跟蹤）和焦點(diǎn)檢測（紅色射線的痕跡）所使用的光學(xué)系統(tǒng)來監(jiān)視和維護(hù)焦點(diǎn)。第一，由LED發(fā)射的近紅外光通過聚光透鏡和狹縫板（具有的長軸垂直于頁面），共用一個共軛平面的玻璃液界面在蓋玻片。準(zhǔn)直透鏡的狹縫狀的光轉(zhuǎn)換成平行束，并將其傳遞通過一個半月形瞳孔限制掩模塊沿光軸的中央?yún)^(qū)域的光的一部分。然后，該光束被透射穿過半反射鏡，它也用作到檢測器上的光學(xué)列車的交點(diǎn)。第一，通過半透半反鏡透射的光聚焦偏移的調(diào)整透鏡系統(tǒng)，然后直接通過之前進(jìn)入主顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的交點(diǎn)的PFS單元作為通過二色鏡的可見光截止濾光器。
交叉的二色鏡（物鏡下方的定位），它反映的近紅外光，并通過可見光，是一個主要組成部分的遠(yuǎn)焦無窮大的空間（平行光的波陣面）的圖像形成，并集中檢測光學(xué)系統(tǒng)。從PFS單元的近紅外光進(jìn)入主光學(xué)系統(tǒng)從反射鏡表面反射后，通過物鏡聚焦到所述切片腔室。請注意，物鏡還操作以同時點(diǎn)亮（在熒光模式下），并接收從檢體的圖像形成的波前。正如在圖3中示出的光學(xué)系統(tǒng)，圖像形成組件包括物鏡，各種二色鏡和過濾器，管透鏡，相機(jī)中繼透鏡，和主CCD圖像檢測傳感器（表示在黃色射線痕跡）。的紅外截止濾光器可以被放置在主光火車之間的PFS交集和相機(jī)系統(tǒng)，以確保從聚焦檢測單元的近紅外光的雜散不干擾圖像形成。
圖3中描繪的可見和紅外截止濾波器用于清洗污染的彼此的光的各自的光學(xué)系統(tǒng)（攝像和PFS）。因此，可見光截止濾光器（放置在入口處的PFS光學(xué)火車）確保熒光發(fā)射和傳輸寬帶可見光輻射不輸入PFS光學(xué)系統(tǒng)和擾亂線傳感器或LED光源。同樣地，位于下方的交叉的二色鏡的紅外截止濾波器用于去除PFS-產(chǎn)生的光進(jìn)入光學(xué)列車的攝像部，并創(chuàng)建由圖像傳感器，可以檢測到的噪聲。因此，這兩個獨(dú)立光學(xué)系統(tǒng)共享只有一小部分的整體成像光學(xué)列車，包括交叉的二色鏡，物鏡，與切片腔室。否則，該光學(xué)系統(tǒng)是能夠共存，并獨(dú)立運(yùn)作。
線狀PFS的近紅外光從玻璃的切片腔室中的水界面反射的光束通過物鏡被捕獲，并轉(zhuǎn)換成在主顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的平行波前。該光被反射回到聚焦探測光學(xué)列車二色鏡相交，并再次穿過前的可見光截止濾光器和偏置調(diào)整透鏡組件被反射到圖像形成PFS由半透半反鏡的檢測用的列車。進(jìn)入后的PFS的檢測系統(tǒng)，其中包含一個冷凝（物鏡）的透鏡，兩個中繼透鏡，一個半月形掩模，柱面透鏡，和一個線CCD探測器中，光被轉(zhuǎn)換成一個圖像的狹縫由聚光鏡頭。狹縫圖像，然后通過中繼透鏡和半月形掩模之前，進(jìn)入圓筒形的線整形透鏡被投影到的表面上的線CCD傳感器。請注意，在檢測光學(xué)列車半月形掩模的光屏蔽對應(yīng)的PFS光學(xué)系統(tǒng)的LED部分由類似的掩模的相同的區(qū)域被屏蔽。一圓柱形透鏡壓縮和形狀的狹縫圖像，以便它形成了一個清晰的線的中央部的CCD。的PFS系統(tǒng)使用形狀的圓形光束，以減少與檢測的玻璃液界面的散射和其他構(gòu)件，而不是由狹縫的光。
PFS單元的一個關(guān)鍵部件是偏置調(diào)整透鏡系統(tǒng)，它位于之間的半反射鏡和第一二色鏡，并與在圖4中的示意圖概述。由于其定位，偏移的透鏡系統(tǒng)，由兩個LED狹縫照明和線CCD圖像形成光學(xué)列車的PFS共享。的偏移量的系統(tǒng)運(yùn)行轉(zhuǎn)移的PFS狹縫圖像的焦點(diǎn)位置在和諧與一個電子反饋循環(huán)，該循環(huán)控制顯微鏡軸向（z）的位置，從而使該系統(tǒng)創(chuàng)建的檢體和玻璃 - 水界面的完全獨(dú)立的焦平面。檢體圖像平面被定向到檢測器或目鏡，通過兩個獨(dú)立的光學(xué)系統(tǒng)的狹縫圖像被定向到的PFS線CCD探測器。
在圖4（a）中，提出的縮寫版本的光學(xué)列車含有只把偏移透鏡和主顯微鏡物鏡，以及檢體和蓋玻片，為了簡潔起見，說明。此外，圖例介紹了參考平面的蓋玻片的下表面上的空氣 - 玻璃界面駐留在用于干物鏡的情況。黃色射線痕跡指的圖像形成的主顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的光波。黃色的光線不通過的PFS光學(xué)列車由于限制上述二色鏡，它指示這些圖像形成的波陣面的目鏡或其他探測器。紅色射線的痕跡綱要重點(diǎn)檢測光波和的PFS單位收集。的偏移量的透鏡組件被稱為為轉(zhuǎn)臺透鏡和在圖4中的偏移量的透鏡。這些透鏡移位的PFS生成的狹縫圖像，這是預(yù)計到蓋玻片接口，來回沿著光軸，他們也同時移動的反射圖像向上或向下跨線CCD探測器的像素。的偏移量的系統(tǒng)的設(shè)計，以使操作者選擇的區(qū)域的切片的物鏡的焦平面重合，同時保持固定的距離的物鏡前透鏡元件和切片蓋玻片之間使用PFS漂移校正硬件。
偏移量的系統(tǒng)炮塔透鏡被固定在光軸上（并入多透鏡刀架），而偏移鏡頭本身允許沿著光軸來回轉(zhuǎn)換的狹縫圖像的位置移動。的PFS單元初始化后，物鏡的焦點(diǎn)（F）和的的PFS狹縫圖像（A）在蓋玻片和介質(zhì)浴的切片（圖圖4（a））之間的界面區(qū)重合。這種情況被稱為零點(diǎn)偏移。為了引入物鏡焦平面和狹縫參考平面的偏移量之間的距離，操作員可以打開的PFS偏移控制器撥號搬遷的偏移量的透鏡，從而狹縫圖像的焦點(diǎn)。在圖4（b）圖中，透鏡被移動的距離為x，這導(dǎo)致在一個移位的狹縫圖像焦點(diǎn)A到一個新的位置更接近物鏡。因為偏移的透鏡具有的物鏡的圖像形成的光波（焦點(diǎn)F）的焦點(diǎn)上沒有影響，正在兩個焦點(diǎn)在相對于彼此偏移。一旦PFS反饋回路調(diào)整搬遷狹縫像焦點(diǎn)在蓋玻片界面（圖圖4（c））的點(diǎn)（A）的物鏡位置，物鏡焦點(diǎn)（F），然后移動到切片的中央部。在操作者的便利性的距離可以改變之間的焦點(diǎn)F和A的偏移量，以及被稱為探測切片中的各種深度。
可與PFS單元的偏移量的范圍是由所使用的類型的物鏡，但通常從蓋玻片上接口（零毫米）范圍內(nèi)，以最大的油浸物鏡大約為10微米，20微米的水浸泡的物鏡，以及高達(dá)至100微米或以上的干性的物鏡。需要注意的偏移范圍內(nèi)降低物鏡的工作距離，因此具有高數(shù)值孔徑的油浸物鏡，具有很淺的震源深度的限制值。成功能夠監(jiān)視的z參考平面的軸向位置的其中一個最重要的方面，是近紅外光在界面處反射的光束的信號強(qiáng)度。使用浸油的物鏡時，油和蓋玻片玻璃之間的界面處的狹縫圖像的反射率是有效的零，因此不會干擾聚焦控制。隨著水浸泡的物鏡，在此界面處的反射率的值等于界面（在切片上側(cè)）的上部的蓋玻片上，但這些高倍率和數(shù)值孔徑物鏡的焦點(diǎn)深度淺，確保不會干擾與PFS控制下反射功能。相反，對于干燥的物鏡，蓋玻片 - 空氣界面處的反射率是10倍大于在切片蓋玻片界面，所以前者接口被用作用于聚焦控制的基準(zhǔn)邊界。到光路中引入適當(dāng)?shù)呐谒哥R可用使用寬范圍的物鏡所需的偏移量的差異可以通過以下方式獲得。
在操作期間，控制的物鏡位置，并反過來，焦平面成像的檢體和PFS狹縫（在圖4中的A和F，分別），是由線CCD傳感器上的狹縫圖像的投影PFS單元，如圖5所示。切片攝像室（參考接口）的情況下，在負(fù)的軸向方向（-z）的偏移，偏移沿的CCD的像素行的一端的狹縫圖像和擴(kuò)大。發(fā)生的反向時，腔室中的正方向（遠(yuǎn)離物鏡偏移;+ z）在顯微鏡光軸。一旦發(fā)生移位的PFS控制器移動的物鏡，在補(bǔ)償?shù)姆较蚧謴?fù)的狹縫圖像的中心的線CCD傳感器。圖5示出了作為焦點(diǎn)位置的函數(shù)，（z）的線CCD傳感器上的狹縫圖像的信號強(qiáng)度。當(dāng)PFS狹縫光被直接聚焦在參考平面上，狹縫圖像重疊線CCD（圖5（a））的中央部。通過在正的軸向方向上的距離越來越大，作為基準(zhǔn)平面的位移的狹縫圖像的擴(kuò)大和移向的線CCD的邊緣（圖5（b）至圖5（d））。在負(fù)的軸向方向移動時發(fā)生的反向參考平面。
線CCD探測器的PFS系統(tǒng)中是一個關(guān)鍵因素，因為來自狹縫圖像投影到CCD表面的信號被直接饋送到控制電子裝置的CPU中的單元，它解釋焦點(diǎn)信息來確定的聚焦?fàn)顟B(tài)收納相對于參考平面的物鏡。 PFS電子必要的信息，然后輸出到正確的位置，帶動物鏡轉(zhuǎn)換器的線性編碼器控制單元（裝在顯微鏡幀）。與加油站所用的每一個不同的物鏡登記的控制電子裝置提供的數(shù)據(jù)，可以使用以建立正確的物鏡轉(zhuǎn)盤位置有關(guān)的物鏡前透鏡單元。 PFS單元被激活時，鼻夾的物鏡驅(qū)動的注冊的垂直位置，然后接近一半的工作距離（約65微米的值對于一個典型的100倍復(fù)消色差物鏡）的切片腔室。在這一點(diǎn)上，所述參考平面（稱為狩獵）的PFS單元搜索，直到它檢測到由線的CCD。在不能檢測到的情況下的參考平面，在搜索操作停止后一個預(yù)定義的時間內(nèi)。過度狩獵當(dāng)被使用或不正確的浸油，如果檢體參數(shù)不符合要求的PFS單元可以是一個問題，這兩個條件，導(dǎo)致線CCD的信號檢測差。這是重要的，以確保有足夠的水溶液（培養(yǎng)基），洗澡的檢體或完全失敗檢測的接口也可以發(fā)生。在理想的情況下，對焦精度的PFS一般不少于三分之一的物鏡，震源深度。
PFS單元的設(shè)計主要是安置在專門的成像室配備蓋玻片在厚度范圍從150到180微米（第1或第1.5蓋玻片）的圖像活細(xì)胞。其他切片可能要困難得多觀察焦點(diǎn)漂移校正由于弱的紅外線反射率或過度的散射光。這些包括高折射率介質(zhì)（更密切地相匹配的蓋玻片）中所裝的固定切片。在這種情況下，從聚焦監(jiān)測系統(tǒng)的反射光的量可能不足以檢測的接口表面。同樣，厚組織切片，其中散布了大量的光，是難以用焦點(diǎn)漂移校正。厚的玻璃蓋玻片（大于180微米）或塑料組織培養(yǎng)皿不推薦，因為可能無法檢測到的邊界表面由于沒有足夠的偏移。最后，蓋玻片表面上的灰塵和碎屑可以降解的邊界檢測的精度，導(dǎo)致過度狩獵或焦點(diǎn)校正的錯誤。
結(jié)論
雖然有幾個商業(yè)上可用的基于硬件的焦點(diǎn)漂移校正系統(tǒng)在市場上，一切都是為了測量反射率從蓋玻片為基礎(chǔ)，其操作界面。主要發(fā)生分歧的方式將每個單元完成這個任務(wù)，而這些變量有顯著影響單位可以成功地檢測出重點(diǎn)和捕捉圖像的速度。另一個主要的不同之處在于在復(fù)雜的例程，需要在一個實(shí)驗中，在不同的橫向和軸向位置的捕獲圖像中的各種系統(tǒng)的能力來處理成像。重點(diǎn)檢測，近紅外光的尼康PFS單位在不影響大多數(shù)形式的發(fā)送和熒光顯微鏡和不漂白或光毒性。切片中的焦點(diǎn)位置的控制由操作者使用的偏移量的功能，可以將焦點(diǎn)保持任何在viewfield位置。與幾乎所有的科學(xué)級CCD或電子倍增CCD攝像系統(tǒng)和用于成像的對比度增強(qiáng)技術(shù)在各種各樣的聚焦控制，可以實(shí)現(xiàn)與PFS。在其中PFS是不需要的情況下，交叉的二色鏡可以容易地從攝像光學(xué)路徑中移除，以提高光的吞吐量。當(dāng)連接到適當(dāng)?shù)沫h(huán)境室和恒溫控制系統(tǒng)，尼康的PFS系統(tǒng)是能夠提供前所未有的精確度，在保持合適的切片中大家關(guān)注的焦點(diǎn)，在整個成像會議。