奧林巴斯顯微鏡：浸入介質(zhì)

捕捉偏離光線從標(biāo)本的顯微鏡物鏡的能力取決于兩者的數(shù)值孔徑和介質(zhì)，通過它的光的行進(jìn)。

數(shù)值孔徑的有關(guān)通過方程的成像介質(zhì)：

數(shù)值孔徑（NA）= N（sin μ）

其中，μ是一個(gè)一半的孔徑角的物鏡和 n是物鏡前透鏡和標(biāo)本蓋玻片之間的介質(zhì)的折射率。

如明顯的數(shù)值孔徑方程上述，一個(gè)物鏡數(shù)值孔徑是成正比的折光指數(shù)（n）的在成像介質(zhì)的蓋玻片和前透鏡之間，并且也1的一半的角孔徑的的罪物鏡。因?yàn)樽飷?span style="font-family:Times New Roman">μ可以不大于90度時(shí)，可能的最大數(shù)值孔徑的浸沒介質(zhì)的折射率確定。大多數(shù)顯微鏡的物鏡使用空氣作為媒介，通過它的光線必須通過保護(hù)標(biāo)本和前面的鏡頭物鏡之間的蓋玻片。這種類型的物鏡被稱為作為干的物鏡，因?yàn)樗鼈兪遣皇褂靡后w的成像介質(zhì)?？諝獾恼凵渎蕿?span style="font-family:Times New Roman">1.0003，非常接近真空，并大大低于大多數(shù)液體，包括水組（n =1.33），甘油組（n =1.470）和常見的顯微鏡浸油（平均n=1.515）。在實(shí)踐中，被限制的干燥物鏡系統(tǒng)的最大數(shù)值孔徑為0.95，和更大的值只能使用用于浸漬介質(zhì)的光學(xué)設(shè)計(jì)來實(shí)現(xiàn)。

浸油的原則，表現(xiàn)在圖1中，其中個(gè)別的光線追蹤的樣本，然后通入的物鏡，或在其他方向上折射。圖1（a）示出的情況下，干燥的物鏡與5條（標(biāo)記為1到5）示出通過一個(gè)示例，用蓋玻片覆蓋。這些光線被折射在蓋玻片 - 空氣界面，只有最接近于光軸（光線1和2）的顯微鏡兩條射線進(jìn)入物鏡前透鏡的適當(dāng)?shù)慕嵌?。第三射線蓋玻片約30度的角度的折射，而不會進(jìn)入的物鏡。最后兩個(gè)射線（4和5）在內(nèi)部通過蓋玻片反射回來，并沿與第三射線，有助于在傾向于降級的圖像分辨率的玻璃表面的光的內(nèi)部反射。當(dāng)空氣被取代油的玻璃，在圖1（b）所示的相同的折射率，光線現(xiàn)在通過直通玻璃 - 油界面無偏差由于折射。因此，數(shù)值孔徑的增加，油的折射率為n的因子。

設(shè)計(jì)用于浸油的顯微鏡物鏡有許多優(yōu)于那些用于干燥。浸沒的物鏡通常是較高的校正（無論是熒光或復(fù)消色差的），并可以有工作的數(shù)值孔徑為1.40時(shí)，使用具有適當(dāng)?shù)姆稚⑿院驼扯鹊慕?。這些物鏡允許臺下聚光隔膜被打開至更大的程度，從而延長照明的標(biāo)本和利用的增加數(shù)值孔徑。

一個(gè)經(jīng)常被忽視的因素，增加數(shù)值孔徑時(shí)使用油浸物鏡是放在臺下聚光系統(tǒng)的限制。在油浸物鏡的NA=1.40的情況下，正被用于圖像臺下聚光器的較小的數(shù)值孔徑（例如1.0）的標(biāo)本具有較低的數(shù)值孔徑的聚光鏡覆蓋的總的物鏡和NA的系統(tǒng)被限制到1.0，在聚光鏡的數(shù)值孔徑。

現(xiàn)代臺下聚光鏡往往具有高的數(shù)值孔徑在1.0和1.40之間的范圍內(nèi)的值的校正程度（見我們對聚光鏡的部分）與。為了有效地利用浸油的所有好處，臺下聚光前透鏡和包含標(biāo)本的顯微鏡載玻片的底面之間的界面時(shí)，也應(yīng)浸在油中。一個(gè)理想的系統(tǒng)的示意性框圖在圖2中，已放置在浸油物鏡前透鏡和標(biāo)本之間的接口，并在聚光鏡前面的鏡頭和底面樣本載玻片之間。

該系統(tǒng)被稱為齊次的沉浸式系統(tǒng)，它是理想的情況下實(shí)現(xiàn)最大數(shù)值孔徑，并在光學(xué)顯微鏡的分辨率。在這種情況下，物鏡前透鏡，浸油，臺下聚光前鏡頭，和安裝介質(zhì)的折射率和分散體是相等的或非常接近相等。在這種理想的系統(tǒng)中，可以通過一個(gè)傾斜的光通過聚光透鏡，并完全通過顯微鏡載玻片，浸油，和安裝介質(zhì)油玻璃或安裝介質(zhì)玻璃接口通過折射不偏執(zhí)。

當(dāng)使用高倍率的消色差透鏡油浸物鏡時(shí)，它有時(shí)是允許省略上油聚光鏡頂部透鏡的步驟。這是因?yàn)?/span>聚光鏡孔徑光闌必須經(jīng)常與較小的校正物鏡減少消除工件，并提供最佳的成像。膜片尺寸的減少，減少的潛在增加數(shù)值孔徑的（上油聚光透鏡設(shè)置），因此在這些條件下，通常是在圖像質(zhì)量的損失可以忽略不計(jì)。

有已設(shè)計(jì)優(yōu)化浸沒顯微鏡技術(shù)各種市售的合成油。許多國家紛紛發(fā)表自己的標(biāo)準(zhǔn)的必要的素質(zhì)，浸油和國際標(biāo)準(zhǔn)組織已經(jīng)認(rèn)識到了ISO8036標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)性能通用的浸油：

除了嚴(yán)格控制的光學(xué)性質(zhì)，浸油還必須表現(xiàn)出合適的物理化學(xué)特性，如非干燥的，惰性的光學(xué)表面的涂層，非熒光，化學(xué)惰性的，無毒的，并易于除去。大多數(shù)顯微鏡制造商是專門匹配的物鏡色散特性，用自己的物鏡提供一個(gè)專門的浸油。請確定您所購買的售后油相匹配的物鏡，油的物鏡是滿足分散條件。許多舊的商業(yè)化生產(chǎn)浸入油（特別是超過10年前制造的）顯著量的多氯聯(lián)苯。這些油是致癌物質(zhì)，應(yīng)避免使用，但大多數(shù)較新的浸泡油是在沒有這種危險(xiǎn)的化學(xué)品和使用是絕對安全的。浸油介質(zhì)的主要制造商為Cargille Laboratories, Inc., Cedar Grove，新澤西生產(chǎn)的油五種標(biāo)準(zhǔn)類型：

?普通光學(xué)顯微鏡 - 最常見的浸油的會議分成兩個(gè)粘度要求（A型和B）：150和1250厘沲。這些油可以混合生成中間產(chǎn)物的粘度。

?高粘度油（NVH）型 - 具有粘度為21000厘沲，這種油倒，水平和傾斜的應(yīng)用程序和極長的工作距離物鏡和標(biāo)本，利用廣泛的聚光鏡差距，也為流行。

?熒光顯微鏡（DF型） - 油產(chǎn)生熒光顯微鏡的最高分辨率。這種油產(chǎn)生的背景色是淺綠色的。

?熒光顯微鏡（FF型） - 改進(jìn)的油，基本上沒有背景熒光，是清晰的，非吸濕性。該油通常被稱為“通用”油，因?yàn)樗梢匀〈膸缀跞魏纹渌麩晒鈶?yīng)用浸油的信心。

表1列出的cargille實(shí)驗(yàn)室浸泡油最常見的三種類型的屬性。

cargille浸油

表1

與普通的浸油的一個(gè)主要的問題是其固有的高的吸收特性，在紫外區(qū)域的頻譜（低于約375納米）。這并不影響與浸沒介質(zhì)所做的可見光的光學(xué)顯微鏡的多數(shù)，但它可能會導(dǎo)致麻煩，當(dāng)試圖在低于400納米的波長的圖像標(biāo)本。甘油的紫外線吸收在400-350納米的區(qū)域是可以忽略不計(jì)的，所以純?nèi)軇?/span>90:10的與水的混合物，可用于與近紫外顯微鏡浸沒技術(shù)。

紅外（IR）顯微鏡與工件所產(chǎn)生的超過700納米的波長處吸收的浸漬材料也很復(fù)雜。紅外顯微鏡的唯一實(shí)際媒體是石蠟油，這也是有用的熒光浸沒顯微鏡，因?yàn)樗哂锌珊雎圆挥?jì)的波長處的熒光下降到350納米。

表2中列出的浸漬介質(zhì)的折射率和有廣泛的各種不同的光學(xué)顯微鏡技術(shù)是有用的。大多數(shù)等于或低于玻璃的折射率的介質(zhì)中使用的共同的生物學(xué)明場，相襯，DIC，和熒光顯微鏡。使用具有非常高的折射率，如溴萘和二*********，與專門的物鏡的那些媒體，以實(shí)現(xiàn)最高的數(shù)值孔徑和分辨率可能，也是非常有用的材料，其具有非常低的或變化的反射率的反射光顯微鏡中。

常見的浸式介質(zhì)

表2

現(xiàn)代的組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)引發(fā)了興趣，能夠?qū)D像的活細(xì)胞和組織，都沐浴在生理鹽水溶液。生物體組織內(nèi)的細(xì)胞動力學(xué)目前正在大量研究與定量的光學(xué)成像技術(shù)，包括共聚焦，微分干涉對比（DIC），和落射熒光顯微鏡?；罴?xì)胞的平均折射率為1.35，非常接近周圍的緩沖水，生理鹽水組（n =1.33），必須存在，以支持正在進(jìn)行的細(xì)胞活動。當(dāng)使用長工作距離干物鏡，可視化的液體，將掩蓋標(biāo)本的詳細(xì)信息，從該表面的反射由于在水溶液中的組織培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，會出現(xiàn)一個(gè)問題。同樣地，使用浸油物鏡觀察活細(xì)胞也是有問題的因成像介質(zhì)和水溶液的物鏡的前透鏡的玻璃之間的折射率差異。

被設(shè)計(jì)成用于成像緩沖生理鹽水溶液中的細(xì)胞和組織中的圖3中示出的物鏡，同時(shí)提供足夠的房間的標(biāo)本在觀察過程中的微操作。在一個(gè)43度角的鼻（或浸漬錐），房屋的前鏡片的物鏡是錐形的，允許提供方便地訪問到標(biāo)本的機(jī)械手或微電極的方法，同時(shí)保持標(biāo)本和物鏡沉浸在一個(gè)陡峭的傾斜的解決方案。這些物鏡也有長工作距離范圍從2.0毫米（60X平場熒光），3.3毫米（10倍 - 40倍平場熒光），使標(biāo)本的顯微操作的額外的空間，同時(shí)也是有用的。在這一系列的物鏡是可比的數(shù)值孔徑（通常是略高）典型的干平場熒光。這種類型的生產(chǎn)顯微鏡的主要公司，包括奧林巴斯，蔡司，徠卡，尼康，物鏡往往是制造商提供額外的配件，用于組織培養(yǎng)標(biāo)本和其他生物標(biāo)本的顯微。

一個(gè)很好的示范精致的細(xì)節(jié)，看到水浸泡物鏡的分辨率和增強(qiáng)生活在組織培養(yǎng)的大鼠提睪肌的觀察圖4所示。

圖4（a）是位于正上方的空氣/水界面的一個(gè)正常的干燥的4倍物鏡采取大鼠組織的顯微照片。注意標(biāo)本的失真和模糊的發(fā)生是由于從水的表面的反射。這些效果被消除在圖4（b），這是相同的視野的顯微照片，但使用一個(gè)4x水浸物鏡。此圖片是相當(dāng)清晰的，較干燥的物鏡提供精致的細(xì)節(jié)顯示更高的分辨率。

與成像的組織樣本的另一個(gè)問題是審查標(biāo)本在高放大倍率時(shí)所表現(xiàn)油浸物鏡的分辨率和照度的有限的范圍內(nèi)。在深度超過10微米的標(biāo)本時(shí)，覆蓋蓋玻片，沐浴在水溶液中的浸泡物鏡通常失去其出色的成像性能。此問題在圖5中示出（a）如射線追蹤表明，在水介質(zhì)中的一個(gè)球體扭曲成一個(gè)顯然是細(xì)長的橢圓形，當(dāng)使用通過浸油具有n=1.515的標(biāo)本圖像的油浸物鏡。

相同的球體保持球形，即使當(dāng)使用水浸物鏡的成像光線仍然必須通過的折射率等于1.515的玻璃蓋玻片。水浸泡的物鏡還消除觀看標(biāo)本通過水溶液時(shí)，往往會產(chǎn)生的球面像差。這些先進(jìn)的物鏡還具有增加的軸向分辨率，經(jīng)常等于數(shù)值孔徑的理論限制，它們產(chǎn)生特殊的對比度，分辨率，和提供了更高的照明強(qiáng)度。

油浸顯微鏡技術(shù)提示 

顯微鏡中的第一規(guī)則是保持光學(xué)元件完全自由的灰塵，污垢，油，溶劑，和任何其他的污染物。顯微鏡時(shí)，應(yīng)保持在低振動無煙房，可能是干凈的循環(huán)空氣的干擾最小。在顯微鏡上使用了防塵罩在不使用時(shí)，在密封的容器內(nèi)，并保持所有配件。避免使用腐蝕性溶劑來清潔的顯微鏡，只能使用稀釋的肥皂水清洗非光學(xué)表面。油應(yīng)保持技術(shù)和頭腦中的注意事項(xiàng)：

?第一步是找到一個(gè)低倍率的物鏡和位置顯微鏡載玻片，讓標(biāo)本與感興趣的區(qū)域是正視載物臺開口的中央部中。人們常常希望旋轉(zhuǎn)浸沒物鏡（無油）到位，以確保正確的位置的標(biāo)本。為了達(dá)到最佳的結(jié)果，當(dāng)使用油浸漬技術(shù)是很重要的，也適用油的底面的顯微鏡載玻片和最佳臺下聚光透鏡的形成兩者之間的，如下所述的油珠。大多數(shù)現(xiàn)代顯微鏡提供了一個(gè)相對寬的橢圓形的開口中的機(jī)械載物臺，以允許油顯微鏡載玻片的底部和在聚光鏡的前透鏡之間的區(qū)域中使用。

?擺動油浸物鏡的位置在物鏡轉(zhuǎn)換器，這將是下一個(gè)物鏡的光學(xué)通路旋轉(zhuǎn)到正上方的標(biāo)本。使用一塊無絨紙或滴管將一小滴的油直接在鏡頭前的油浸物鏡。下一步，將另一滴的油蓋玻片上的正上方的區(qū)域進(jìn)行成像。許多較新的奧林巴斯和尼康生產(chǎn)的油浸物鏡使用平凹前鏡片在浸泡物鏡，這是必要的步驟注油的物鏡前透鏡不能省略這些物鏡的。如果這些物鏡，以填補(bǔ)凹腔“，可能會導(dǎo)致截留一個(gè)微小的氣泡，造成嚴(yán)重的眩光和圖像質(zhì)量下降。

?慢慢地降低石油的物鏡，在顯微鏡的蓋玻片使用粗調(diào)焦旋鈕成小的油池。當(dāng)油覆蓋的物鏡前透鏡使蓋玻片上的油接觸時(shí)，一個(gè)小閃光燈的散射光會被排放在油交界處，這兩個(gè)油池，合并。此步驟要非常小心，因?yàn)樨浖艿?/span>物鏡太靠近蓋玻片，可能會導(dǎo)致兩者之間的碰撞，有可能造成損害。

?將樣本慢慢地成為關(guān)注的焦點(diǎn)，使用粗調(diào)，直到細(xì)節(jié)才剛剛開始成為可見的，然后切換到適當(dāng)?shù)慕咕辔⒄{(diào)，將樣本。它是重要的，以記住，在工作距離的最熒光和復(fù)消色差透鏡的物鏡是減少超過十分之一毫米的，在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)微調(diào)旋鈕，所以仔細(xì)監(jiān)視的物鏡的做法油池而降低它的粗或細(xì)的調(diào)整。雖然大多數(shù)高倍率的浸油的物鏡有彈簧加載的可以縮回到主體的物鏡，這些物鏡的不小心使用的前端仍然可以驅(qū)動物鏡進(jìn)入標(biāo)本滑動造成損害。

?許多顯微鏡所使用的另一種方法是在顯微鏡的光路中，使用較低的倍率物鏡的中心的區(qū)域?qū)⒈怀上竦奈恢?。接著，油浸物鏡（無油的情況下）被放置到光路中，并且標(biāo)本的感興趣區(qū)域的大致中心的視野帶入并集中。此預(yù)位置所有準(zhǔn)備加入油中的系統(tǒng)組件。浸沒物鏡擺動顯微鏡物鏡轉(zhuǎn)盤相鄰站和適用油的物鏡前透鏡和標(biāo)本如上面所討論的。接下來，快速旋轉(zhuǎn)上油的物鏡，上述兩個(gè)油滴（對標(biāo)本的物鏡之一）合并到一個(gè)池中的樣本的位置?，F(xiàn)在已經(jīng)準(zhǔn)備好標(biāo)本是觀察和顯微攝影。

適用于石油臺下聚光鏡頭前，使用以下考慮：

?請肯定的是，在顯微鏡的機(jī)械載物臺具有足夠的尺寸的開口，允許掃描不溢出的情況下的載物臺的底部上的油在油標(biāo)本。許多先進(jìn)的的研究顯微鏡有一個(gè)載物臺插入是可移動使用油。涂油的聚光鏡頂級鏡頭前取出標(biāo)本的顯微鏡載物臺。

?在注油一個(gè)物鏡的類似的方式，放置在顯微鏡載玻片上的底部和一滴油臺下聚光的前透鏡的應(yīng)用類似的下降。確保聚光鏡略有下降，在舞臺上的顯微鏡載片上，然后再更換機(jī)架?；脽羝笠恢狈胖迷谖枧_上，機(jī)架背面的聚光鏡，到適當(dāng)?shù)奈恢?，同時(shí)仔細(xì)觀察油滴的聚光鏡和顯微鏡幻燈片。這些液滴合并成一個(gè)，作為的聚光鏡被帶到正確的位置。

?當(dāng)您掃描的表面上油顯微鏡幻燈片，定期觀察載物臺方面的物鏡和聚光鏡的前鏡頭，以確保有一個(gè)連續(xù)的液滴這些元素之間的石油和顯微鏡幻燈片的位置。顯微鏡載片上在大面積上進(jìn)行掃描時(shí)，它往往是必要重新應(yīng)用一些油以保證連續(xù)性的成像介質(zhì)。