奧林巴斯顯微鏡：特殊應(yīng)用的物鏡

也許多達(dá)90％的光學(xué)顯微鏡的調(diào)查進(jìn)行，利用標(biāo)準(zhǔn)消色差或平場(chǎng)消色差的物鏡，這是*便宜，*容易買到的，并已經(jīng)安裝在世界各地的大型基座顯微鏡。大部分的顯微鏡制造商還提供了各種各樣的物鏡，具有**的配置，以執(zhí)行特定的功能，通常不會(huì)發(fā)現(xiàn)的常見的實(shí)驗(yàn)室顯微鏡。

標(biāo)準(zhǔn)的明場(chǎng)物鏡，用于不同程度的光學(xué)像差校正，是*常見的，并與傳統(tǒng)的照明技術(shù)，如明場(chǎng)，暗場(chǎng)，和萊因伯格檢查標(biāo)本是有用的。這些方法涉及幾個(gè)臺(tái)下聚光的修改，但仍然可以帶或不帶平場(chǎng)校正利用標(biāo)準(zhǔn)的消色差透鏡，熒光，和/或復(fù)消色差透鏡物鏡。其他更復(fù)雜的，技術(shù)要求具體物鏡的配置，這往往包括放置的檢測(cè)器的后側(cè)焦平面上或附近。復(fù)雜的問(wèn)題，客觀上后焦平面通常居住在中心的內(nèi)部玻璃鏡片，一個(gè)領(lǐng)域是不容易的奧林巴斯顯微鏡。

物鏡設(shè)計(jì)的相位相反，霍夫曼調(diào)制對(duì)比度和微分干涉對(duì)比，需要光學(xué)檢測(cè)器的協(xié)助下修改客觀的后側(cè)焦平面處發(fā)生的事件。這些物鏡必須被特別地構(gòu)造，物理地放置在適當(dāng)?shù)慕蛊矫鎯?nèi)的物鏡物體的檢測(cè)元件。相襯的物鏡（如下面討論的）需要含有中性密度材料和/或光的波緩凝劑的后側(cè)焦平面的相位板的插入。此外，該相位板必須被放置到一個(gè)匹配的環(huán)形圈定位在臺(tái)下聚光共軛?；舴蚵繕?biāo)還需要在客觀的后側(cè)焦點(diǎn)面，在聚光鏡中的狹縫板的共軛的調(diào)制板。微分干涉對(duì)比物鏡一般不要求修改（其他比無(wú)應(yīng)變光學(xué)元件的利用），但依靠的行動(dòng)渥拉斯頓或利用Nomarski棱鏡策略性地放置影響剪切的光束之間的光程差的后側(cè)焦平面的。其他專門目標(biāo)依賴于修改的光學(xué)元件，或斜反射鏡，可調(diào)節(jié)的孔，和/或可移動(dòng)元件的插入執(zhí)行**的功能。詳細(xì)討論了關(guān)于這些物鏡的具體要求，在本節(jié)其余部分。

相位對(duì)比 - 這是一個(gè)經(jīng)典的半透明，未染色的標(biāo)本，如微生物和細(xì)胞活組織培養(yǎng)，已采用由生物學(xué)家在過(guò)去的50年中引入對(duì)比度的方法。相襯操縱個(gè)別光線的相位之間的關(guān)系，因?yàn)樗鼈儼l(fā)出的標(biāo)本，并將其轉(zhuǎn)換成幅度或亮度變化的顯微鏡可見的。一個(gè)特殊的物鏡是必需的，其裝配與黑暗的圓環(huán)或凹槽（相位差板），在圖1中所示的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面附近，裝入玻璃。此外，還必須進(jìn)行修改聚光鏡適合于一個(gè)特定的倍率和客觀的具有特殊的環(huán)形開口。相位對(duì)比物鏡被分隔成若干內(nèi)部相位環(huán)的建造和中性密度取決于類別：

 ·DL (Dark-Light) - DL目標(biāo)產(chǎn)生暗的圖像輪廓，淺灰色的背景上。這些物鏡旨在提供*強(qiáng)的明暗反差標(biāo)本中有重大差異的折射率。 DL相襯物鏡檢查細(xì)胞和其他半透明的生活材料，是*流行的款式，尤其適合于顯微攝影和數(shù)字成像。

 ·DLL（(Dark Lower Contrast） - 類似DL物鏡，DLL一系列允許更好的明場(chǎng)圖像，經(jīng)常被用來(lái)作為一個(gè)“通用”的物鏡，利用多種照明模式，如熒光，DIC，明場(chǎng)和暗場(chǎng)顯微鏡系統(tǒng)。

 ·ADL(Apodized Dark-Light) - 尼康*近推出的變跡相位對(duì)比ADL物鏡包含次要的中性密度環(huán)的兩邊相環(huán)。有助于減少不必要的“光環(huán)”效應(yīng)往往在相差顯微鏡成像上增加的二次環(huán)。

 ·BM(Bright-Medium)  - 通常被稱為負(fù)相襯，BM物鏡中型的灰色背景上產(chǎn)生明亮的圖像輪廓。 BM的物鏡是理想的細(xì)菌鞭毛蛋白，纖維蛋白束，分球，血細(xì)胞計(jì)數(shù)的目視檢查。

為了使顯微鏡相襯的物鏡快速識(shí)別，很多廠家銘刻重要的指標(biāo)，如放大倍數(shù)，數(shù)值孔徑，管長(zhǎng)度校正等，在綠色字母的外桶。這是為了區(qū)分普通明場(chǎng)，偏光，DIC，熒光的物鏡，使用另一種顏色的代碼或標(biāo)準(zhǔn)的黑色字體相襯的物鏡。

微分干涉對(duì)比（DIC） - 利用Nomarski差分干涉對(duì)比度也是有用的未染色標(biāo)本，但與雙折射樣品是不太有效的，并且可以用于與反射光的金相和晶片檢查。 DIC物鏡內(nèi)部修改，但使用特殊的放大倍率取決于改性沃拉斯頓或諾馬斯基的棱鏡設(shè)計(jì)，產(chǎn)生高對(duì)比度的圖像。也是有用的，這些物鏡是明場(chǎng)，暗場(chǎng)和其他技術(shù)的棱鏡時(shí)，從光路中除去。由于DIC的顯微鏡利用偏振光，應(yīng)變?cè)谶@種類型的應(yīng)用設(shè)計(jì)的物鏡，必須盡量減少。在過(guò)去，只有無(wú)應(yīng)力消色差透鏡，平常消色差物鏡，和一些高性能的熒光物鏡的人非常適合這項(xiàng)工作。然而，*近在鏡頭設(shè)計(jì)的改進(jìn)和防反射涂層允許利用DIC觀察，顯微攝影和數(shù)字成像的復(fù)消色差物鏡。DIC棱鏡與使用用于與目標(biāo)通常是刻有擬耦合與物鏡的特定棱鏡（低，中，高，或1，2，3，等）。

霍夫曼調(diào)制對(duì)比度(Hoffman Modulation Contrast) - 霍夫曼調(diào)制對(duì)比系統(tǒng)的物鏡是通過(guò)檢測(cè)光梯度（或斜坡），并把它們轉(zhuǎn)換成光強(qiáng)度的變化，旨在提高染色的和有生命的物質(zhì)的可見度和對(duì)比度。調(diào)制對(duì)比度的物鏡有一個(gè)**的光振幅空間濾波器，被稱為一個(gè)調(diào)制器，插入到一個(gè)消色差或平常消色差物鏡（盡管也可以使用更高的校正因子）的后側(cè)焦點(diǎn)面（參見圖2）。該調(diào)制器具有三個(gè)不同的中性密度區(qū)傳輸?shù)娜我粋€(gè)，15，或百分之百通過(guò)的光通過(guò)物鏡。與相襯物鏡的相位板不同，霍夫曼調(diào)制器設(shè)計(jì)不改變相位的任何區(qū)域的光線穿過(guò)。下觀看時(shí)，調(diào)制對(duì)比度光學(xué)，本質(zhì)上是不可見的透明物體，在普通的明視野顯微鏡采取由相位梯度決定試樣中表觀三維外觀?；舴蚵镧R設(shè)計(jì)中已經(jīng)取得了*近的創(chuàng)新模式，允許使用一個(gè)調(diào)制器內(nèi)的物鏡相反方向變化。一旦調(diào)整，對(duì)比度方向保持*過(guò)整個(gè)倍率范圍內(nèi)，在一組匹配的物鏡。

紅外顯微鏡 - 光學(xué)顯微鏡在電磁輻射光譜的紅外區(qū)域往往是在可見光譜中是均勻透明的或不透明的材料，研究進(jìn)行，但有顯著的吸收或傳輸頻帶在700毫微米以上的波長(zhǎng)區(qū)域。反射光為紅外顯微鏡技術(shù)的選擇，和幾個(gè)專門反射的物鏡已捕捉到的圖像反射的紅外光從不透明的標(biāo)本。

顯微鏡雖然所有的物鏡發(fā)射一定程度的紅外線波長(zhǎng)較短，極少數(shù)是在這一地區(qū)的畸變校正和*越，從可見光到紅外光時(shí)，表現(xiàn)出顯著的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移。大多數(shù)制造商提供專業(yè)化的物鏡，降低的數(shù)值孔徑，旨在增加深度的焦點(diǎn)標(biāo)本中紅外光成像。標(biāo)準(zhǔn)油，只適用于浸漬液中，目前紅外顯微鏡是石蠟油，油浸物鏡將無(wú)法正常運(yùn)作。使用傳統(tǒng)的成像技術(shù)，這種類型的顯微鏡主要關(guān)注的是能夠捕捉到滿意的顯微圖像。目前，幾個(gè)膜乳劑是可用的響應(yīng)的紅外光譜，但迅速成為電子探測(cè)器給出的攝像裝置，在該波長(zhǎng)范圍內(nèi)的研究。

干擾顯微鏡 - 干涉顯微鏡標(biāo)本的研究通過(guò)利用干擾時(shí)產(chǎn)生的光通過(guò)一個(gè)對(duì)象一直遵循一個(gè)有些不同的通路的參考光束的光造成的干擾。在這些情況下，不透明的表面上的反射光的檢體或透明的標(biāo)本時(shí)，成像的兩束光之間的路徑差被轉(zhuǎn)換成強(qiáng)度波動(dòng)。各種各樣的顯微鏡和物鏡設(shè)計(jì)已實(shí)施了干涉顯微鏡，許多馬赫 - 曾德誠(chéng)，雅憫干涉遵循的基本原則。工業(yè)顯微鏡（反射和透射）的制造商往往會(huì)產(chǎn)生專門的物鏡/顯微鏡的組合，利用光的干涉現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)高精度測(cè)量。

偏振光 - 與大多數(shù)其他形式的顯微鏡，偏光顯微鏡產(chǎn)生*佳圖像時(shí)，*低的光學(xué)元件中使用的建設(shè)物鏡。這是重要的，以確保應(yīng)變和雙折射材料，可能會(huì)干擾與定量評(píng)估的試樣的雙折射透鏡元件，光學(xué)水泥，和防反射涂層是免費(fèi)的。復(fù)消色差的物鏡，選擇大多數(shù)形式的顯微鏡，一般不用于偏振光調(diào)查由于內(nèi)部透鏡元件的高數(shù)量，往往有助于內(nèi)部反射和應(yīng)變。大多數(shù)制造商生產(chǎn)的物鏡，專門針對(duì)偏振光，微分干涉對(duì)比，*經(jīng)常被用于這些目的與的熒光類物鏡。物鏡優(yōu)化偏振光經(jīng)常有外觀部分涂成黑色的桶，同規(guī)格銘刻在鮮紅的字母（圖3）。

紫外線熒光物鏡 - 落射熒光的應(yīng)用需要高數(shù)值孔徑物鏡，隱隱發(fā)出熒光標(biāo)本，以捕捉*大的光量。具體試樣的熒光的特性的背景熒光的比率成為主要關(guān)注當(dāng)成像單分子和其他低光熒光事件。在這些情況下，可以干擾自發(fā)熒光和/或物鏡內(nèi)的內(nèi)部反射成像的小的結(jié)構(gòu)和低熒光物鏡。

熒光的物鏡的設(shè)計(jì)與石英和特殊的眼鏡，其具有通過(guò)從紫外（下降到340納米）的電磁輻射光譜的紅外區(qū)域的高傳輸。這些物鏡是非常低的自體熒光，以優(yōu)化作為次要熒光的熒光基團(tuán)連接至樣品發(fā)出的光通量。在除了特殊的透鏡元件，紫外（UV）氟物鏡利用專門的光學(xué)水泥和防反射涂層，通過(guò)整個(gè)頻譜的擴(kuò)展范圍的熒光激發(fā)的設(shè)計(jì)操作。在紫外氟物鏡的光學(xué)像差和數(shù)值孔徑值的校正通常接近的復(fù)消色差，這有助于這些*的透鏡（圖4）所產(chǎn)生的圖像的圖像的亮度和增強(qiáng)的分辨率。此外，這些物鏡與非熒光玻璃的設(shè)計(jì)，以盡量減少由內(nèi)部透鏡元件所產(chǎn)生的自發(fā)熒光的工件。高性能的熒光目標(biāo)的主要缺點(diǎn)是，許多不校正場(chǎng)曲，導(dǎo)致圖像中的整個(gè)視場(chǎng)中不具有均勻的聚焦。雖然這個(gè)問(wèn)題是只有二次關(guān)注成像時(shí)，弱熒光的標(biāo)本（尤其是使用激光掃描共聚焦顯微鏡）的物鏡時(shí)，用于執(zhí)行根據(jù)現(xiàn)有的照明技術(shù)，如明場(chǎng)，暗場(chǎng)，和微分干涉對(duì)比，它成為一個(gè)重大問(wèn)題。

反射光的物鏡 - 設(shè)計(jì)要一起使用的蓋玻璃的透射光的物鏡是不適合用于研究反射光的標(biāo)本，其表面被揭露。相反，專門用于反射光顯微鏡標(biāo)本的觀察和成像校正的物鏡，這些物鏡不需要蓋玻片。今天，大多數(shù)反射光顯微鏡的無(wú)限遠(yuǎn)校正物鏡，可提供廣泛的放大倍數(shù)從5倍到200倍不等。這些物鏡是制造各種款式的色差和校正球差，范圍從簡(jiǎn)單的消色差透鏡，平常消色差，平場(chǎng)復(fù)消色差。多數(shù)情況下，但不是所有的，被設(shè)計(jì)要使用的“干”的物鏡和標(biāo)本之間的空間中的空氣。許多反射光的物鏡的設(shè)計(jì)集中在一個(gè)較長(zhǎng)的工作距離從檢體，通常是比（見下文）。這些物鏡被標(biāo)記的物鏡桶LWD（長(zhǎng)工作距離），ULWD（*長(zhǎng)工作距離），ELWD（*長(zhǎng)工作距離）。

設(shè)計(jì)用來(lái)與反射暗場(chǎng)照明的物鏡有一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)，由圍繞位于中心的透鏡元件（圖5）的一個(gè)360度的中空室。從照明的光通過(guò)的物鏡的外周和沖著每方位角傾斜射線將試樣從照明以形成一個(gè)中空的錐形。這通常是由位于物鏡的中空室的底部的圓形的反射鏡或棱鏡的裝置來(lái)完成的。以這種方式，物鏡作為兩個(gè)獨(dú)立光學(xué)系統(tǒng)耦合的同軸等，作為“聚光鏡”和內(nèi)作為一個(gè)典型的物鏡系統(tǒng)的系統(tǒng)功能的外。

周圍的透鏡元件在反射光中的物鏡的中空軸環(huán)的必要性需要物鏡的直徑顯著大于普通明場(chǎng)物鏡。在大多數(shù)情況下，物鏡轉(zhuǎn)換器安裝螺紋直徑大于皇家顯微學(xué)會(huì)（RMS）的標(biāo)準(zhǔn)采用的是反射光的物鏡。這需要，反射的光的暗視野物鏡有一個(gè)物鏡轉(zhuǎn)換器具有較大的螺紋尺寸，這通常被稱為作為BD或BF / DF螺紋尺寸。大多數(shù)制造商提供客觀的適配器轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)的RMS的螺紋尺寸物鏡轉(zhuǎn)換器 BD螺紋尺寸，允許使用這些物鏡的反射光顯微鏡。應(yīng)小心，以確保，將符合，用于在BD螺紋物鏡轉(zhuǎn)換器顯微鏡的管長(zhǎng)度。

變量數(shù)值孔徑物鏡 - 不尋常的高熒光量子產(chǎn)率和/或非常明亮的暗場(chǎng)標(biāo)本的標(biāo)本，往往誘發(fā)圖像眩光焦平面以外的地區(qū)發(fā)出的光。為了彌補(bǔ)這件神器，制造商提供高數(shù)值孔徑物鏡都配有一個(gè)內(nèi)部的虹膜式光圈，以增加圖像的對(duì)比度，在顯微攝影或數(shù)字成像。打開或關(guān)閉的光圈光闌0.5和物鏡的上限（1.35-1.4與復(fù)消色差物鏡;圖6）之間產(chǎn)生一個(gè)可變的數(shù)值孔徑范圍內(nèi)的物鏡后孔的大小決定的。雖然虹膜隔膜曾經(jīng)被使用在各種各樣的客觀的設(shè)計(jì)，現(xiàn)代的可變數(shù)值孔徑的物鏡通常是在高端（60倍至150倍）的倍率范圍。

*低放大倍率物鏡 - 物鏡有以下4倍的放大系數(shù)被認(rèn)為是非常低的放大倍率（見圖7），并可能與所有顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)不兼容。一般來(lái)說(shuō)，科勒照明是難以實(shí)現(xiàn)的，與低倍率物鏡，這往往需要專門匹配的聚光鏡，以填補(bǔ)后孔有足夠的照明。*近已經(jīng)取得的放大倍率下，以0.5倍的，但這些物鏡需要特殊的管透鏡和聚光鏡，使他們僅在，它們被設(shè)計(jì)的顯微鏡有用。

長(zhǎng)工作距離（LWD） - 這些目標(biāo)是設(shè)計(jì)來(lái)增加較常規(guī)的物鏡通過(guò)使用特殊的光學(xué)元件的工作距離。*有用的應(yīng)用為L(zhǎng)WD物鏡是活細(xì)胞組織培養(yǎng)通過(guò)支持細(xì)胞厚厚的船只的墻壁。這些物鏡的其他用途是通過(guò)厚的玻璃板（例如，兩個(gè)顯微鏡載玻片之間），或當(dāng)圖像樣本試樣的顯微操作，必須同時(shí)進(jìn)行觀看。反射光的物鏡也具有長(zhǎng)的工作距離大的標(biāo)本的檢驗(yàn)，將通常太笨重正常的顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)的范圍內(nèi)，以適應(yīng)生產(chǎn)。

特約作者
Kenneth R. Spring - 科學(xué)顧問(wèn)，Lusby，馬里蘭州，20657。
H. Ernst Keller - 一個(gè)蔡司博士，卡爾蔡司公司，索恩伍德，NY，10594。
Michael W. Davidson - 國(guó)家強(qiáng)磁場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室，佛羅里達(dá)州塔拉哈西佛羅里達(dá)州立大學(xué)博士，1800東狄拉克（Paul Dirac）博士，32310。