徠卡顯微鏡熒光觀察法

熒光觀察法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的用途，如免疫學(xué)研究的對(duì)象是抗原和抗體的反應(yīng)問(wèn)題，由于抗體反應(yīng)的高度特異性，所以當(dāng)抗原體發(fā)生反應(yīng)時(shí)，只要知道其中一個(gè)因子，也就可以知道另一個(gè)因子。
但是這個(gè)過(guò)程必須通過(guò)染色，熒光染色劑就應(yīng)運(yùn)而生。
由于熒光染色的色素只需極稀的濃度便能使激發(fā)出明亮的熒光。因而，染色后不會(huì)破壞抗體（或抗原）原有的特異活性。
其光學(xué)原理示意圖如下，以藍(lán)光激發(fā)為例：

激發(fā)濾光片                                     熒光本                       截止濾光片

光源發(fā)出多種波長(zhǎng)的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只能通過(guò)某種單色的激發(fā)光，熒光標(biāo)本在激發(fā)光作用下，激發(fā)出某種特定的顏色光（熒光）。由于被激發(fā)的熒光能量很弱，只能在黑暗的背景才易于觀察
到，所以增加了抑制濾光片使殘余的激發(fā)光不能通過(guò)。
早期的熒光觀察采用透射照明，它有很大的缺陷，當(dāng)激發(fā)光透過(guò)標(biāo)本組織時(shí)，很大部分的光線被衰減掉，到達(dá)我們需觀察的標(biāo)本上表面時(shí)，只能激發(fā)出微弱的熒光。
近代的熒光觀察采用落射照明，如下圖所示：

圖中 ：
1．光源
2. 激發(fā)濾光片
3. 物鏡
4. 標(biāo)本
5. 二向性分光鏡
6. 抑制濾光片
7. 目鏡

A> 光源
根據(jù)不同的激發(fā)光需要，可以選用三種光源，鹵素?zé)簦邏汗療艉碗療?。下圖列出菲利浦公司高壓汞燈和氙燈的光譜特性曲線。

高壓汞燈的光譜特性曲線                          氙燈的光譜特性曲線

由圖知，高壓汞燈是線狀光譜，對(duì)于某些波長(zhǎng)光線有很高的強(qiáng)度，它適用很多染色法。
氙燈在300～800nm 波長(zhǎng)內(nèi)幾乎可以看作連續(xù)光譜，雖然是某些波長(zhǎng)的強(qiáng)度不如汞燈，但它適用于所有熒光染色法。
鹵素?zé)粢彩沁B續(xù)光譜，它在藍(lán)光，綠光處也有較高的強(qiáng)度（但遠(yuǎn)低于汞燈，氙燈）因此，對(duì)于只用藍(lán)光，綠光激發(fā)的簡(jiǎn)易熒光顯微鏡可以選用鹵素?zé)簟?br/>通常采用50W汞燈，100W 汞燈75W氙燈及100W 鹵素?zé)糇鳠晒夤庠础?br/>圖中物鏡既起成象作用，又起聚光鏡作用。為了獲得很好的觀察效果，在熒光很微弱的場(chǎng)合如細(xì)菌發(fā)出的熒光。建議采用大數(shù)值孔徑物鏡，如徠卡的熒石物鏡，平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡。
正因?yàn)槲镧R又兼聚光鏡作用，所以物鏡中玻璃材料，透鏡間膠合劑，以及浸油必須確保在激發(fā)光下不會(huì)自發(fā)熒光。
為了使用方便，常將激發(fā)濾光片，二向性分光鏡及抑制濾光片組合成一個(gè)模塊。對(duì)于不同的熒光染色法，必須選用合適的模塊才能得到滿意的結(jié)果。所謂二向性分光鏡對(duì)激發(fā)光具有高反射率，而對(duì)激發(fā)出的熒光具有高透過(guò)率。

B> 常用熒光模塊
一般熒光模塊有如下四種：
近紫外光激發(fā)模塊――UV、 紫光激發(fā)模塊――V、 藍(lán)光激發(fā)模塊――B、 綠光激發(fā)模塊――G
這些模塊對(duì)應(yīng)著不同染色法，如B 模塊常用FITC 染色法，G 模塊常用羅達(dá)明B200 染色法。
必須特別指出，激發(fā)光的波段曲線絕對(duì)不能與抑制光的波段曲線部分重迭，否則，視場(chǎng)中的背景
光全部是激發(fā)光的顏色,而微弱的熒光完全被掩蓋住,正如白天天空中無(wú)法看到星光一樣。

1─激發(fā)光 2─抑制光

藍(lán)光激發(fā)如用FITC 染色法，它的激發(fā)波段為480～490nm,被激發(fā)的熒光波長(zhǎng)為510nm。由圖知，無(wú)論激發(fā)光或抑制光在500 nm 處均截止，無(wú)相交重迭。所以，殘留的激發(fā)光無(wú)法通過(guò)截止濾光
片，視場(chǎng)背景是黑暗的，而熒光則可順利地透過(guò)截止濾光片，形成熒光圖像。
徠卡公司設(shè)置了許多模塊，供不同的染色法選用：

注意：
許多熒光標(biāo)本無(wú)法長(zhǎng)期保存，特別在激發(fā)光照射下，熒光很快消失。所以，在停止觀察時(shí)，應(yīng)該將激發(fā)光擋。但是汞燈開(kāi)啟到熄滅后，第二次再啟動(dòng)時(shí)，必須待燈源冷卻后才能進(jìn)行。為此，須在模塊前設(shè)置一擋板（Shutter），可隨時(shí)關(guān)閉、開(kāi)啟。

                                           熒光“激發(fā) / 發(fā)射”模塊

標(biāo)本圖像(藍(lán)光激發(fā))                                              標(biāo)本圖像(紫外光激發(fā))

標(biāo)本圖像(綠光激發(fā))                                      標(biāo)本圖像(藍(lán)光+紫外光激發(fā))