徠卡顯微鏡：熒光相關光譜
熒光相關光譜（FCS）的測量的熒光強度的波動，在一個子femtolitre卷來檢測這樣的參數，擴散時間，熒光標記的分子的分子或暗的狀態(tài)數。在20世紀70年代初，該技術是自主研發(fā)的瓦特·韋伯和魯道夫Rigler。的術語FCS鑄造，由韋伯實驗室。這項突破性的技術是引進共焦光學Rigler和同事，在20世紀90年代初增加其靈敏度單分子水平。隨著更高的靈敏度與激光掃描共聚焦顯微鏡FCS儀表的可用性乘以其效用生物學。應用包括分子大小，聚集狀態(tài)，綁定和生化反應動力學，無論是在體外和在體內的測定。
FCS - 的方法
FCS是一個光譜的方法。在這種情況下，“比色皿”是受衍射限制的點（圖1）。因此，使用顯微鏡的原因，是具有高數值孔徑的透鏡將光束聚焦到一個femtoliter大小的光斑。一個可喜的副作用有顯微鏡能夠采取的樣品圖像引用和定位測量點（ROI）。在FCS小學讀出熒光強度隨時間（熒光的跟蹤或強度跟蹤）。的熒光的波動隱式編碼的粒子數（即振幅波動）和粒子的停留時間（即頻率的波動），見圖2。一個進行自相關分析，（“自相似性”試驗）和曲線擬合，定量地獲得這些參數（圖3和4）。共聚焦點的激發(fā)和檢測的光的幾何形狀大致如下一個三維的正態(tài)分布。近似高斯函數，人們可以找到FCS自相關函數的分析模型。它的參數和它們的物理意義總結于表1。
圖 1（左）：觀察量和重要的參數。擴散時間τ D 表示分子觀察量內花費的時間，即需要多長時間橫向擴散。的橫向延伸（光束束腰），瓦特 0 ，和軸向延伸部分和z 0 的觀察量（右側）。他們比? 0/瓦特 0 是偏心率或結構參數，κ。
圖。2（右）：熒光強度跟蹤。流入和流出的觀察量（上排）的分子的運動導致的熒光強度的隨機波動。
圖 3（左）：自相關原理。熒光跟蹤乘以本身被復制，并總結出的結果。這樣做是為了多次，每次移增量設定的第二數據τ 的（滯后時間）。小的滯后時間后，數據仍然是自相似的，產生一筆較大（紅色）。更長的轉變意味著更小的數字（綠色和藍色）。這種技術通過觀察量的分子擴散的頻率分析中的基本信息。 詳細“解剖”的FCS曲線，即過程的觀察在什么時間域，以及一般介紹的主題，請參閱佩特拉Schwille和埃爾克·斯特因一篇網上文章 參數 名 意義 ρ 電流幅度 G（0）振幅貢獻的分子種 τ e 擴散時間 V EFF內花費時間分子 τ ? 三胞胎時間 在黑暗狀態(tài)下度過時間分子 ? 三聯分數 在黑暗狀態(tài)下的分子分數 κ 結構參數 的V EFF的偏心率，κ= Z 0 / W 0 表1：三維高斯三重模型數據擬合一個分子物種和正常擴散3D參數。 FCS測量感興趣的是兩個主要的參數的擴散系數，τ e，分子的數目，N.他們直接相關的擴散系數D，和濃度角分別。然而，無論τ e和N，是由每個單獨的儀器和一些實驗參數的影響的相對數。取得的*編號D和c是儀器校準的目的。 這兩個參數，擴散時間和數目的分子，這取決于觀察量的大小。應當這里所指的有效容積，V EFF。校準是確定的V EFF的大小。 三種方法確定V 效率的文獻中描述： 共焦量用熒光珠在3D及裝修的一個三維高斯函數的測量。 準備濃度系列和N作為繪制c的函數。斜率產生V EFF。 已知的染料與已知的D.曲線擬合產量測量τ e和κ，其中V 效率可以計算出來。 每種方法都有其缺點和優(yōu)點。對于實施例1。共焦量，給出了一個確切的描述細節(jié)以及3D高斯近似持有。這是不測量在水溶液中的實際測量一樣。第二種方法是modelfree的，V EFF或擴散模型的幾何形狀作出任何假設。因此，它含有沒有關于它的形狀，它是費力，而且可能遭受黑暗的狀態(tài)，如果無科幻擬合曲線被用來估計N，但它工作在一個大的濃度范圍內。*后一種方法的條件下，非常接近實際FCS測量，包含了一些信息的幾何形狀的V EFF可以輕松實現。在下面，我們將研究這一戰(zhàn)略一步一步。所有三種方法進行了詳細的比較。 由于這種方法是基于曲線擬合的結果，質量非常強烈的依賴，對如何做好模型描述了現實。*強的假設是一個三維高斯幾何形狀的V EFF，通常做在FCS分析。因此系統(tǒng)的錯位將導致違反了這一假設。此外，一個很好的信號-噪聲比的自相關是必需的，因為τ e和κ都確定擬合相同的數據集。這是*好的滿足明亮，光穩(wěn)定的染料在水中的濃度范圍從0.1納米到10納米[1] 。的有效體積，然后給出在方程1。 公式1：有效容積。觀察體積的大小有關的FCS測量與瓦特 0 的橫向和z 0 的軸向延伸。這兩個參數依賴于τ D 和κ得到的曲線擬合的校準測量。請注意，這V 有效的是大于2 ^（3/2）?2.8的一個因素在文獻中通常被稱為共焦體積。
圖。4（右）：自相關函數G（τ）被繪制在滯后時間t。從圖3（紅，綠，藍點），G（τ 的）代表不同的滯后時間定性繪制。在G（0）的振幅，編碼的粒子數N的時間在半*大振幅（INFL撓度點）產生的逆擴散時間τ D 的，也被稱為為相關時間。從這些數字中，我們可以得到的濃度c和擴散系數D使用適當的校準。3D高斯三聯模型
校準 - 從相對*數字，
有效體積
校準策略
通過曲線擬合得到的有效容積
