奧林巴斯顯微鏡物鏡的圖像形成

奧林巴斯顯微鏡物鏡的圖像形成

在光學(xué)顯微鏡下，當(dāng)光從顯微鏡燈穿過(guò)聚光鏡，然后通過(guò)樣品（假設(shè)試樣的光吸收片），一些光穿過(guò)兩個(gè)周?chē)?，并通過(guò)不受干擾在其路徑中的檢體。 這樣的光稱(chēng)為直接光或未偏射光。 背景光（通常稱(chēng)為環(huán)繞）繞過(guò)試樣也是未偏射光。 另一方面，一些穿過(guò)樣品的光的它遇到試樣的部件時(shí)偏離。

這樣偏離光（如你將隨之學(xué)習(xí)，稱(chēng)為衍射光）被呈現(xiàn)半波長(zhǎng)或180度的步驟（更常見(jiàn)的是，異相）與已經(jīng)通過(guò)非偏移直射光。 二分之一波長(zhǎng)出來(lái)所引起的試樣本身相使該光以引起破壞性干擾與直射光時(shí)都在目鏡的膜片到達(dá)中間像平面。 目鏡的眼透鏡進(jìn)一步放大這個(gè)圖像，*終投射到視網(wǎng)膜或相機(jī)膜。

現(xiàn)在的情況是，直接或未偏射光由物鏡投射并均勻地分布在整個(gè)圖象平面上的目鏡的孔徑光闌。 由檢體衍射的光被送到聚焦在同一平面上的圖像的各種局部的地方，如示于圖2; 并且有衍射光導(dǎo)致破壞性的干擾，并且減少了導(dǎo)致或多或少暗區(qū)的強(qiáng)度。 明暗的這些模式是什么，我們認(rèn)識(shí)到作為檢體的圖像。 因?yàn)槲覀兊难劬Φ淖兓炼让舾校瑘D像就變成原來(lái)試驗(yàn)片的或多或少忠實(shí)重建。

為了幫助您了解的基本原則，因此建議你試試下面的練習(xí)，并為你的“標(biāo)本”已知結(jié)構(gòu)，對(duì)象使用如載物臺(tái)微米的緊密排列的暗線或類(lèi)似的光柵。 要繼續(xù)，放在顯微鏡載物臺(tái)的精細(xì)刻劃光柵，并使用*10倍，然后在40倍物鏡使其焦點(diǎn)。 取下目鏡，在其位，插入一個(gè)載物臺(tái)望遠(yuǎn)鏡，這樣就可以專(zhuān)注于物鏡的后焦面。 如果您關(guān)閉聚光鏡孔徑光闌大部分的方式，你會(huì)看到光的亮白色中心點(diǎn)是孔徑光闌的圖像。 到右側(cè)和中央點(diǎn)離開(kāi)，你會(huì)看到一系列光譜，每個(gè)顏色的藍(lán)色*靠近中央的現(xiàn)貨和紅色從中央亮點(diǎn)頻譜*遠(yuǎn)（部分部分，如圖3 ）。 根據(jù)多遠(yuǎn)的頻譜是從中央點(diǎn)這些有色光譜的強(qiáng)度減小。

這些光譜接近物鏡的周邊比向中央點(diǎn)的調(diào)光器。 這是通過(guò)使用三種不同的放大倍數(shù)示出在圖3中。 在圖3（b）中，在10倍的物鏡的后焦平面的衍射圖案示出了兩個(gè)衍射光譜。 如果從載物臺(tái)除去光柵，如圖3（a）中，這些光譜消失，孔徑光闌的只有中央圖像保持。 如果你把后面的光柵光譜重新出現(xiàn)。 需要注意的是彩色光譜之間的空間顯得較暗。 如果檢查光柵與10倍的物鏡，你會(huì)看到，只有一對(duì)光譜中可以看出，一個(gè)中央點(diǎn)，1到右邊的左邊。 如果檢查行以60倍的物鏡光柵（如圖3（D），假設(shè)它比你的40倍更高的數(shù)值孔徑），你會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的頻譜，以左，右比你能看到的40倍（圖3的（c））在適當(dāng)位置。

由于有色光譜當(dāng)光柵被去除消失，則可以假定這是樣品本身是通過(guò)影響光通過(guò)，由此產(chǎn)生的著色光譜。 此外，如果你關(guān)閉了孔徑光闌，你會(huì)發(fā)現(xiàn)，較高的數(shù)值孔徑的物鏡，“抓”更多這樣的彩色光譜比低數(shù)值孔徑的物鏡。這兩個(gè)語(yǔ)句的理解圖像形成的極端重要性將變得清晰，在隨后的段落。

光的中心光點(diǎn)（聚光鏡孔徑光闌的圖像）代表的直接或未偏射光穿過(guò)樣品或周?chē)皇芨蓴_樣品（示于圖4（b））。 這就是所謂的第0或零級(jí)。 上零級(jí)的每一側(cè)的孔徑孔徑光闌的微弱著色圖像被稱(chēng)為*，第二，第三，第四，等等分別訂單，通過(guò)模擬衍射圖案在圖4中（a）表示，將在被觀察一40倍物鏡的后側(cè)焦平面。 所有的“捕獲”的命令表示，在這種情況下，線光柵作為在物鏡的后焦平面可見(jiàn)的衍射圖案。

孔徑光闌的微弱著色衍射圖像是由光偏離或衍射引起的，分布在風(fēng)扇的形狀，在各線光柵的開(kāi)口（圖4（b））。 藍(lán)色波長(zhǎng)的光被衍射以比綠色波長(zhǎng)，這是在比紅色波長(zhǎng)較小角度較小的角度。

在物鏡的后焦平面，從每個(gè)狹縫藍(lán)色波長(zhǎng)長(zhǎng)干涉，以產(chǎn)生每個(gè)光譜或命令的衍射圖像的藍(lán)色區(qū)域; 同樣為紅色和綠色的區(qū)域（如圖4（a））。 其中，衍射波長(zhǎng)1/2波為每個(gè)這些顏色的步驟，海浪消干涉。 因此，光譜或訂單之間的暗區(qū)。 在零級(jí)的位置，從每個(gè)狹縫所有波長(zhǎng)建設(shè)性地相加; 這將產(chǎn)生明亮的白光看到作為在物鏡的后焦面（圖3和4）的中心的零階。

一行的間隔光柵越接近，越少將被“俘獲”由一個(gè)給定的物鏡，如示于圖5中。圖5（a）的捕獲由一個(gè)40×物鏡成像的下部中所示的衍射圖案的光譜行光柵中如圖5（b），其中所述狹縫更靠近在一起。 在圖5（c），其物鏡是專(zhuān)注于線光柵（如圖5（b）），并且更光譜由物鏡捕獲的上部。 直接光，并從衍射級(jí)的光繼續(xù)上，被聚焦的物鏡，到中間像平面處的目鏡的孔徑光闌。 這里的直接和衍射光線干涉，并因此重組到所“看到”的目鏡的眼透鏡，并進(jìn)一步放大了真實(shí)，倒象。 這示于圖6中使用兩種類(lèi)型的衍射光柵。 在圖6中所示的方格（a）表示在網(wǎng)格的無(wú)畸變圖象（即通常的檢體圖像）通過(guò)物鏡的全孔徑看去，在從該網(wǎng)格得到的衍射圖案被示為一個(gè)錐光圖像將在物鏡的后焦平面可以看出。 同樣地，一六邊形排列格子的無(wú)畸變圖象（圖6（c））的產(chǎn)生的一階衍射圖案的相應(yīng)六角形排列錐光圖像（圖6（D））。

奧林巴斯顯微鏡標(biāo)本可以被認(rèn)為是復(fù)雜的光柵的細(xì)節(jié)和各種尺寸的開(kāi)口。 成像的概念在很大程度上是由阿貝，19世紀(jì)德國(guó)**的顯微鏡和光學(xué)理論家發(fā)展。 根據(jù)阿貝（他的理論已被廣泛接受，在當(dāng)前時(shí)刻），檢體的細(xì)節(jié)將得到解決，如果物鏡“捕捉”的光的和至少所述*順序太0次; 或任何兩個(gè)數(shù)量級(jí)。 衍射級(jí)是獲準(zhǔn)進(jìn)入物鏡的數(shù)量越多，越準(zhǔn)確的圖像將代表原始對(duì)象。

此外，如果高的折射率比空氣（如浸油）的培養(yǎng)基中使用的空間中的物鏡的前透鏡和蓋玻片頂部之間（如圖7（A））的，角度衍射訂單減少，衍射光的球迷被壓縮。 這樣一來(lái)，一個(gè)油浸物鏡可以“捕獲”更多的衍射訂單和產(chǎn)生更好的分辨率比干燥的物鏡（圖7（b））。

此外，由于藍(lán)色光被衍射以比任一綠色光或紅色光的較小角度，一個(gè)給定的孔徑的透鏡可以捕捉的光的更多的訂單時(shí)的光為藍(lán)色。 這兩個(gè)原則解釋經(jīng)典的瑞利判據(jù)經(jīng)常被引用的解析：

其中 d是兩個(gè)相鄰的粒子（仍然允許顆粒被感知為獨(dú)立）之間的空間中，λ是波長(zhǎng)，NA是物鏡的數(shù)值孔徑。

考上物鏡較高衍射級(jí)的數(shù)量越多，可被清楚地分離試樣的細(xì)節(jié)的較小的（解決）。 因此，對(duì)于這樣的標(biāo)本高數(shù)值孔徑的值。 同樣，較短的可見(jiàn)光的使用的波長(zhǎng)，更好的分辨率。 這些想法解釋為什么高數(shù)值孔徑，復(fù)消色差透鏡可以單獨(dú)在藍(lán)光非常小的細(xì)節(jié)。(奧林巴斯顯微鏡)

如果是通過(guò)將一個(gè)遮光光闌在物鏡的后方來(lái)阻擋*外側(cè)衍射級(jí)，則可以減少光柵，或任何其他的詳細(xì)對(duì)象的線條的分辨率，或“破壞”的決議共使得樣品將不可見(jiàn)。 因此，平時(shí)注意不要關(guān)閉建議的2 / 3-4 / 5的物鏡的孔徑光闌下聚光鏡孔徑光闌。

物鏡失敗“抓手”的任何的衍射級(jí)的結(jié)果在一個(gè)未解決的圖像（如圖8的（a））。 因?yàn)?，在具有非常微小的?xì)節(jié)試樣，衍射風(fēng)扇散布在一個(gè)非常大的角度，高數(shù)值孔徑物鏡是需要“捕獲”它們。 同樣地，由于衍射風(fēng)扇被壓縮在浸油或水，設(shè)計(jì)用于這種用途的物鏡可以給比干物鏡更好的分辨率。 從變化的分辨率的物鏡獲得的衍射圖案，因?yàn)闆](méi)有由物鏡捕獲更高衍射級(jí)示出在圖8的左側(cè)，如圖8沒(méi)有分辨率的圖像。 在圖8的（b）和（c）的方式顯示，越來(lái)越多的衍射級(jí)指示更好的分辨率的標(biāo)本作為訂單被通過(guò)物鏡抓起。

如果備用衍射級(jí)不被改變（仍假定光柵作為我們的樣品），在光柵的行數(shù)會(huì)出現(xiàn)加倍（寄生分辨率）。 重要的要注意的是，在物鏡的后孔引入的動(dòng)作可以具有在產(chǎn)生的*終圖像顯著效果。

對(duì)于在一個(gè)樣品（而不是光柵）的小細(xì)節(jié)，物鏡項(xiàng)物鏡直接和衍射光到在被稱(chēng)為艾里磁盤(pán)（如圖9）小，圓形衍射圓盤(pán)的形式目鏡光闌的像面。 高數(shù)值孔徑的物鏡“捕獲”更多的衍射級(jí)的生產(chǎn)更小尺寸磁盤(pán)比低數(shù)值孔徑的物鏡。 在圖9中，艾里斑的大小示出從圖9（a）至圖9（C）的穩(wěn)定下降。 在圖9中的磁盤(pán)大?。╝）和（b）在較低的數(shù)值孔徑物鏡的生產(chǎn)，而非常尖銳的艾里斑在圖9的（c）是由非常高的數(shù)值孔徑的一個(gè)物鏡制備。

在目鏡膈肌水平產(chǎn)生的圖像實(shí)際上是你所認(rèn)為的光明與黑暗的艾里磁盤(pán)的馬賽克。 其中，兩個(gè)磁盤(pán)過(guò)于靠近在一起，使得它們的中心的黑點(diǎn)重疊很大，由這些重疊磁盤(pán)表示的兩個(gè)細(xì)節(jié)都沒(méi)有解決或分離并因此顯示為一個(gè)（圖10中（a）所示）。

其基本原理是，直接和衍射光（或直接或衍射光的操縱）的組合在圖像形成至關(guān)重要。 關(guān)鍵的地方，例如操作是物鏡的后焦面和臺(tái)下聚光鏡的前焦平面。 這一原則是至關(guān)重要的大多數(shù)在光學(xué)顯微鏡對(duì)比度改進(jìn)方法; 它是特別重要的，在高倍率的小細(xì)節(jié)關(guān)閉在尺寸上的光的波長(zhǎng)。 阿貝在開(kāi)發(fā)這些概念來(lái)解釋成像吸收或所謂的幅度標(biāo)本的先驅(qū)。 在1930年，F(xiàn)rits Zernike（弗里茨澤尼克），荷蘭物理學(xué)家，擴(kuò)展了這些原則時(shí)，他設(shè)計(jì)并解釋相差顯微鏡。