奧林巴斯顯微鏡激光掃描共聚焦進(jìn)行活細(xì)胞成像的技巧探討
近年來(lái)隨著生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，活細(xì)胞顯微成像實(shí)驗(yàn)變得越來(lái)越重要。細(xì)胞中很多重要生命活動(dòng)的研究，如細(xì)胞的分裂、分化，細(xì)胞遷移，蛋白質(zhì)的運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，都必需通過(guò)用顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞成像才可以觀察并記錄到。對(duì)于顯微成像來(lái)說(shuō)，激光掃描共聚焦顯微鏡（以下簡(jiǎn)稱(chēng)confocal）是獲得高分辨率特別是高的z軸分辨率圖像的利器。這與confocal 的設(shè)計(jì)原理相關(guān)，confocal的光路中設(shè)置了針孔（pinhole），能夠擋住來(lái)自于標(biāo)本非焦平面的雜散光，因此可以獲得薄的光學(xué)切片，極大地提高了z軸的分辨率。隨著confocal的普及，用confocal進(jìn)行活細(xì)胞成像的需求越來(lái)越多。但是由于confocal儀器自身的特點(diǎn)，以及活細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的苛刻要求，如何用confocal進(jìn)行活細(xì)胞成像需要很多的技巧，而且對(duì)confocal的性能要求也特別高。下面我們就用confocal進(jìn)行活細(xì)胞成像遇到的問(wèn)題以及技巧進(jìn)行探討。
一、保證細(xì)胞正常的生長(zhǎng)環(huán)境
在用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像時(shí)，焦平面的漂移問(wèn)題一直是困擾廣大科研工作者的問(wèn)題之一?；罴?xì)胞延時(shí)實(shí)驗(yàn)往往需要在confocal上放置活細(xì)胞培養(yǎng)裝置，如圖所示，必需保證細(xì)胞處于一個(gè)合適的生長(zhǎng)環(huán)境，能夠進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝。這個(gè)活細(xì)胞培養(yǎng)裝置需要溫度保持在37℃，通入5%濃度的CO2氣體，并加水保證濕度達(dá)到100%。當(dāng)成像時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，高倍物鏡也需套上一個(gè)加溫裝置，給物鏡加溫。
二、如何克服用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像中的焦平面漂移問(wèn)題。
產(chǎn)生焦平面漂移的主要原因在于利用高倍物鏡成像時(shí)，由于需要以水或者油為介質(zhì)，因此熱量會(huì)通過(guò)介質(zhì)從物鏡傳遞到培養(yǎng)皿中，延時(shí)成像過(guò)程中，顯微鏡金屬機(jī)身的熱脹冷縮使焦平面發(fā)生漂移。由于高倍物鏡成像的焦深比較短，對(duì)于焦平面的漂移容忍度很低，因此在采集圖像過(guò)程中，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)熒光圖像越來(lái)越弱，越來(lái)越不清晰，直至無(wú)法采集到任何熒光圖像。
為了克服這個(gè)問(wèn)題，我們往往在利用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像時(shí)，必需用到焦點(diǎn)零漂移補(bǔ)償系統(tǒng)（Zero Drift Compensator, 簡(jiǎn)稱(chēng)ZDC）。ZDC的工作原理是以一束789nm的遠(yuǎn)紅外激光探測(cè)培養(yǎng)皿與介質(zhì)之間的反射面，從而利用offset值糾正焦平面的漂移，使采集到的圖像始終處于在焦?fàn)顟B(tài)。以?shī)W林巴斯新的激光掃描共聚焦顯微鏡FV1200為例，該款產(chǎn)品搭載了*新IX3-ZDC系統(tǒng)，不僅具有可以幫助用戶(hù)快速找到標(biāo)本焦平面的“一鍵式聚焦”的模式，還具有“連續(xù)鎖焦”模式，很好的解決了用戶(hù)在進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)，因加藥而引起的焦平面漂移問(wèn)題。保證了需要進(jìn)行加藥的測(cè)鈣實(shí)驗(yàn)或者FRET實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
此外，F(xiàn)V1200搭載的IX83顯微鏡機(jī)身采用了閉合結(jié)構(gòu)及高剛性設(shè)計(jì)，極大地提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。配合IX3-ZDC極大降低了活細(xì)胞延時(shí)成像中的Z軸和XY軸方向的漂移問(wèn)題。
三、如何克服用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像中的標(biāo)本熒光淬滅的問(wèn)題。
標(biāo)本熒光的淬滅俗稱(chēng)標(biāo)本的漂白，是指標(biāo)本因受到光照射而出現(xiàn)的熒光信號(hào)逐漸變?nèi)跎踔翙z測(cè)不到的現(xiàn)象。在用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像時(shí)，主要有兩方面的因素，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)本熒光淬滅。原因之一是在目鏡下觀察標(biāo)本時(shí)，標(biāo)本受到汞燈等的照射，可能會(huì)出現(xiàn)淬滅。第二個(gè)原因，也是*主要的原因在于，用confocal成像時(shí)，標(biāo)本因受到激光的逐點(diǎn)照射掃描，更容易出現(xiàn)淬滅。針對(duì)這兩個(gè)原因，首先，在制備標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該加入放淬滅劑，防止標(biāo)本熒光信號(hào)較快地淬滅。其次，用目鏡觀察標(biāo)本時(shí)，需要盡可能縮短光照時(shí)間，降低激發(fā)光強(qiáng)度，注意使用電動(dòng)shutter等。*后，在進(jìn)行激光掃描成像時(shí)，應(yīng)該盡量降低激光的光強(qiáng)度。仍以?shī)W林巴斯FV1200為例，F(xiàn)V1200搭載的IX83顯微鏡，采用了大靶面新鍍膜技術(shù)的激發(fā)塊，對(duì)激發(fā)和發(fā)射光的透過(guò)率更高，可以用較弱的激發(fā)光，在目鏡下觀察到更亮的熒光信號(hào)。更為重要的是，F(xiàn)V1200的掃描振鏡進(jìn)行了**，采用了**的鍍銀技術(shù)，其反射效率高于傳統(tǒng)的鍍鋁振鏡的反射效率。特別是在780nm左右的波段，XY掃描振鏡總的反射效率*大可以提高2倍，這樣就可以盡可能用低的激光的強(qiáng)度來(lái)采集較亮的熒光信號(hào)。另外，F(xiàn)V1200上面可以配備高靈敏度制冷的磷砷化鎵（GaAsP）檢測(cè)器。這種檢測(cè)器的優(yōu)勢(shì)是QE值比普通PMT要高，特別適合采集比較弱的熒光信號(hào)。QE值是指光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)的效率，QE值越高，光電轉(zhuǎn)換效率越高。普通的多堿性PMT檢測(cè)器QE值低于30%，而GaAsP檢測(cè)器的QE值在450nm-600nm波段均達(dá)到45%左右。用同樣的熒光標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，以同樣強(qiáng)度的510nm激光掃描圖像，其余條件不變，我們檢測(cè)到的熒光信號(hào)的亮度可以提高30倍。GaAsP檢測(cè)器具有低于室溫10℃的制冷功能，可以使暗電流降低70%左右，采集到的圖像更加明亮、信噪比更高。
綜上所述，在用confocal進(jìn)行活細(xì)胞延時(shí)成像的實(shí)驗(yàn)中，我們要注意使用活細(xì)胞培養(yǎng)裝置，保證細(xì)胞正常的生長(zhǎng)環(huán)境。此外，成像中使用ZDC防止焦平面漂移。盡量降低激發(fā)光強(qiáng)度避免標(biāo)本熒光信號(hào)淬滅。只有滿足了上述條件，才可能采集到比較好的熒光圖像。