尼康顯微鏡：在多光子激發(fā)顯微術(shù)的基本原理和應(yīng)用
雙光子激發(fā)顯微鏡（也稱為非線性的，多光子或雙光子激光掃描顯微鏡）是一種替代共聚焦和去卷積顯微鏡三維成像，提供了明顯的優(yōu)勢。特別是，雙光子激發(fā)成像擅長的活細胞，尤其是在完整的組織，如腦切片，胚胎，整個器官，甚至整個動物。有效靈敏度的熒光顯微鏡，特別是與厚的樣品，通常是有限的焦點外的喇叭形。此限制，大大降低了在共聚焦顯微鏡中，通過使用共焦針孔拒絕焦點外的背景熒光，并產(chǎn)生?。ㄐ∮?微米），unblurred的光學(xué)部分。另外，解卷積顯微鏡采用了常規(guī)的顯微鏡數(shù)字重建的圖像，使用的測量的光學(xué)系統(tǒng)的點擴散函數(shù)。
本文介紹了多光子激發(fā)的基本物理原理的描述，并討論了其使用激光掃描顯微鏡的優(yōu)點和局限性。為了說明這種技術(shù)的實用程序，并顯示出一定的物理限制，實際的考慮因素突出。*后，選定的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)顯微鏡進行了討論，以說明如何此技術(shù)允許實驗，根本不可能被執(zhí)行，否則。
進行任何光學(xué)切片實驗之前，應(yīng)認真考慮選擇的技術(shù)是*適合提供答案的問題正在調(diào)查中。為了在相對厚的樣品的熒光顯微鏡，雙光子激發(fā)往往以提供*適合的解決方案，但互補的三維熒光顯微鏡的方法具有特別的好處，給他們每個人的優(yōu)勢，在某些實驗。
利用激光共聚焦顯微鏡的針孔，以排除從檢測出的離焦背景熒光。因此，這種技術(shù)允許三維成較厚的組織切片。然而，激發(fā)光產(chǎn)生熒光，從而產(chǎn)生整個試樣的光漂白和光毒性，即使信號只從聚焦的平面內(nèi)，收集。這種大的激發(fā)量能引起顯著的漂白和光毒性的問題，尤其是在活體標本。此外，在共聚焦顯微鏡的穿透深度穿過波束路徑的，由試樣散射的激發(fā)和發(fā)射光子吸收激發(fā)能量是有限的。
解卷積技術(shù)通常提供*佳解決方案的樣品外的焦點的背景相對較低的或整體信號電平低的試樣。因為卷積方法采用傳統(tǒng)的寬視場顯微鏡進行圖像采集，激發(fā)強度一般保持在低水平。因此，反褶積通常是有效的活細胞成像單層的。重要的是要意識到，但是，許多所謂的反褶積方法是簡單的非線性數(shù)據(jù)篩選不產(chǎn)生定量數(shù)據(jù)。只有真正的約束迭代卷積技術(shù)產(chǎn)生的量化的數(shù)據(jù)，可用于進一步的分析。然而，在寬視場熒光顯微鏡進行反褶積提供了有限的滲透到厚的樣品，由于增加外的焦點的背景和光散射。此外，由于大量的計算需求，反褶積的圖像無法提供即時反饋，在實驗過程中。
雙光子激發(fā)，在本文中進一步討論的那樣，提供了三維光學(xué)切片沒有吸收（這將導(dǎo)致光漂白和光毒性）的焦點的平面的上方和下方。因此，該技術(shù)提供了更高的穿透深度共聚焦顯微鏡相比，可以降低光毒性活標本。因此，使用雙光子激發(fā)顯微鏡，優(yōu)先于其他技術(shù)，需要深入滲透到生活的組織或完整的動物標本的實驗。然而，由于管的雙光子激發(fā)的光物理是不同于常規(guī)熒光激發(fā)的，有害的影響偶爾觀察物鏡的熒光基團，這反過來又限制了該方法的適用性的薄樣品的光學(xué)切片的雙光子激發(fā)的。
雙光子激發(fā)的原理
雙光子激發(fā)在量子光學(xué)是一個比較老的理論概念。這是*次提出由瑪麗亞G?ppert - 梅耶在她的博士論文和實驗觀察到的一些30年后，激光發(fā)明后不久。因此，相當理解的理論和實驗研究的背景存在。來自在一個單一的量化后的事件的同時吸收兩個光子的雙光子激發(fā)的現(xiàn)象。由于光子的能量是它的波長成反比，必須具有兩個吸收的光子的波長大約兩倍所需的單光子激發(fā)。例如，熒光基團，通?？梢晕兆贤夤猓úㄩL約350納米）也可以被激發(fā)的兩個光子的近紅外光（約700納米波長），如果兩者在同一時間到達的熒光基團（見圖1）。在這種情況下，“同時”是指約10×E（-18）秒的時間間隔內(nèi)。
因為取決于同時吸收雙光子激發(fā)，由此產(chǎn)生的熒光與激發(fā)光強度的平方而變化。這種二次激發(fā)和發(fā)射之間的關(guān)系產(chǎn)生用雙光子激發(fā)顯微鏡（在下面更詳細討論）相關(guān)聯(lián)的許多顯著的優(yōu)點。為了產(chǎn)生顯著的雙光子吸收事件（兩個光子的熒光團與在同一時間），光子密度必須是約一百萬次，需要生成相同數(shù)量的單光子的吸收。其后果是非常高的激光功率需要產(chǎn)生顯著的雙光子激發(fā)熒光。這個功率電平是很容易實現(xiàn)對焦模式鎖定（脈沖）激光器，其中的脈沖峰值期間的功率是高到足以產(chǎn)生顯著的雙光子激發(fā)的平均激光功率，同時保持相當?shù)汀?/span>在這種情況下，將所得的雙光子激發(fā)態(tài)，并且發(fā)射發(fā)生進行常規(guī)的熒光實驗時，所填充的是相同的單重態(tài)。因此，熒光發(fā)射的雙光子激發(fā)后，在正常的單光子激發(fā)產(chǎn)生的發(fā)射完全一樣。圖1給出了雅布隆斯基示出一個單一的（紫外線）的光子同時吸收兩個近紅外光子（圖1（b））（圖1（a））的吸收，產(chǎn)生相同的激發(fā)態(tài)。
另一個密切相關(guān)的非線性光學(xué)過程中，三光子激發(fā)，也可能被證明是有益的生物學(xué)實驗。三光子激發(fā)發(fā)生在大致相同的方式作為雙光子過程中，除了三光子必須同時與熒光團產(chǎn)生排放。由于吸收熒光的量子力學(xué)性能，所需的三光子激發(fā)的光子密度僅約十倍大于所需的雙光子吸收（而不是另一個百萬倍更大）的密度。三光子激發(fā)，因此，可以考慮一些實驗中的一個有吸引力的選擇。紅外線激光（約1050納米的波長）作為一個例子，可以制作三光子激發(fā)的紫外線吸收的熒光團（350納米），并同時引起的吸收綠光的熒光基團的雙光子激發(fā)（在525納米） 。此外，可以采用三光子激發(fā)有用的成像區(qū)域擴展到深紫外光（例如，使用720納米的光來激發(fā)熒光團，通常在240納米的紫外線吸收）。這是一個有價值的傳統(tǒng)顯微鏡的能力增強，因為低于約300納米的紫外線的波長是非常有問題的常規(guī)光學(xué)顯微鏡。高階非線性效應(yīng)，如四光子的吸收，實驗已證明，雖然這是不可能的，這些現(xiàn)象會發(fā)現(xiàn)任何立即在生物學(xué)研究中的應(yīng)用。
雙光子激發(fā)激光掃描顯微鏡
相當大的優(yōu)勢，在激光掃描顯微鏡中的雙光子激發(fā)產(chǎn)生的基本的物理原理的吸收依賴于激發(fā)光強度的平方。在實踐中，所產(chǎn)生的雙光子激發(fā)一個單一的脈沖激光通過光學(xué)顯微鏡。由于激光束聚焦，光子變得更擁擠（其空間密度的增加），其中兩個相互作用的同時，一個單一的熒光基團的增加的概率。的激光焦點沿光子擁擠到足以產(chǎn)生顯著發(fā)生雙光子激發(fā)的光路中的*位置。圖2示意性地示出顯微鏡的試樣在焦點中的熒光基團的含雙光子激發(fā)產(chǎn)生。上述焦點，光子密度不夠高，在同一瞬間通過一個單一的熒光基團的吸收截面內(nèi)的兩個光子。然而，在焦點處，光子是如此緊密地間隔開，這是未能發(fā)現(xiàn)它們兩者同時一個單一的熒光基團的吸收橫截面內(nèi)。
在實踐中，雙光子激發(fā)顯微鏡不僅可能集中光子空間（通過聚焦光學(xué)顯微鏡），也通過集中時間（通過利用從鎖模激光脈沖）。將合并的效果可以生成必要的雙光子激發(fā)的光子強度，但脈沖的占空比（脈沖之間的時間除以脈沖的持續(xù)時間），10×E（-5）平均輸入功率限制到低于10毫瓦，這僅僅是略大于共聚焦顯微鏡中使用的。雖然被認為是*短激光脈沖持續(xù)時間，通常為約100飛秒1皮秒（10×E（-13）到10×E（-12）秒）之間，在約10×E的熒光團的吸收事件相比（-18）秒，持續(xù)時間相對較長。
雙光子激發(fā)的照明焦點狹窄的定位的基礎(chǔ)的技術(shù)的*重要的優(yōu)勢，激光共聚焦顯微鏡。在共聚焦顯微鏡中，雖然整個試樣激發(fā)熒光照明的音量，只在焦平面信號通過共焦針孔，允許無背景要收集的數(shù)據(jù)。與此相反，雙光子激發(fā)產(chǎn)生熒光的焦平面上，由于沒有產(chǎn)生的背景熒光，針孔不是必需的。共聚焦和雙光子激發(fā)顯微鏡激發(fā)區(qū)域的這種戲劇性的差異可以證明，由成像的光漂白型態(tài)的每個方法。圖3示出在xz重復(fù)掃描，在熒光素染色福爾瓦的膜一個單一的xy平面（圖像平面）的方向上從所產(chǎn)生的光漂白柄。漂白的激光激發(fā)熒光團共聚焦系統(tǒng)的焦平面上（在圖3（a）所示的白色的框）的上方和下方，有助于觀察到這些廣泛的領(lǐng)域。與此相反，只發(fā)生雙光子激發(fā)的焦平面上，和漂白，因此只限于這方面的（圖3（b））。
許多有利影響，導(dǎo)致激發(fā)雙光子顯微鏡技術(shù)的本地化。也許*重要的是，雙光子激發(fā)顯微鏡的三維分辨率是相同的，以實現(xiàn)在一個理想的共聚焦顯微鏡。此外，因為沒有聚焦在試樣區(qū)域的吸收，更多的激發(fā)光穿過試樣的焦點平面。其結(jié)果，大大增加了試樣的滲透，一般是大于兩次或三次未能用激光共聚焦顯微鏡。利用雙光子激發(fā)（在圖3中示出）的另一個好處是光漂白和光損傷的*小化 - 熒光顯微鏡，活細胞和組織中的兩個*嚴重的局限性。雖然通過與光的相互作用引起的細胞損傷所知甚少，很顯然，減小光損傷會導(dǎo)致受調(diào)查的生物標本的擴展的可行性。從實際經(jīng)驗中的證據(jù)的紅色激發(fā)光本身并不影響細胞活力，并有可能大部分觀測到的光損傷伴有雙光子吸收，因此被限制到焦平面。
雙光子激發(fā)顯微鏡不需要針孔取得三維的分辨率，允許靈活地檢測的幾何形狀。檢測退掃描和非退雙光子激發(fā)的幾何結(jié)構(gòu)，如圖4所示。在退掃描的幾何形狀，發(fā)出的光（圖中以藍色）作為激發(fā)光沿著相同的路徑返回，撞擊前掃描鏡通過共焦針孔的檢測器（圖4（a））。在共聚焦顯微鏡中，必須利用這種幾何形狀，以消除檢測聚焦發(fā)射。非退束路徑提供多個配置的替代品：共軛平面檢測器的布置定位后，立即的物鏡（圖4（b）條，并反映所發(fā)出的光通過一傳遞透鏡放置在一個平面上的共軛到檢測器的分色鏡客觀的后孔;由一個外部檢測器直接從檢體所發(fā)出的光可能會被收集，而不通過所述物鏡（圖4（c），或所發(fā)出的光由二向色反射鏡被轉(zhuǎn)移到一個電荷耦合器件（CCD）相機在中間像平面中，為了獲得寬視場圖像（圖圖4（d））。這后一種幾何配置適用于快速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)中，采用雙光子激發(fā)。
雖然這是可以用于雙光子激發(fā)，以便充分利用這種技術(shù)的穿透深度，使用退掃描檢測，建議使用一個非退的選擇（外部檢測器）。非退的路徑使收集更多的散射光子，需要較少的光學(xué)元件，例如反射鏡和透鏡，并減少路徑的長度，沿其在空氣中的灰塵顆粒的熒光信號干擾。因此，使用非退的檢測方法，用雙光子激發(fā)的顯著提高收集效率，并且是必不可少的*大深度滲透到活組織。
深切片機制
如上所述，雙光子激發(fā)顯微鏡***的優(yōu)勢是它能夠提供**的光學(xué)切片厚的樣品更大的深度比通過其它方法是可能的。，因此，重要的是要了解通過何種方式實現(xiàn)這種穿透深度增加。三個物理機制存在功能組合，讓增加的效益，在厚厚的標本：
無外的病灶吸收，使更多的激發(fā)光的光子，以達到所需的檢體的水平。
雙光子激發(fā)經(jīng)過紅光和紅外光散射比少光的藍顏色（波長較短）。
光散射的影響是不利的雙光子顯微鏡，共聚焦顯微鏡比。
雖然功能組合，它是有用的，單獨考慮的三種機制。雙光子顯微鏡允許更大比例的激勵照明達到，因為吸收的條件不能滿足以外的區(qū)域的光線集中，并消除吸收聚焦在焦平面。在共聚焦顯微鏡中，激發(fā)光子被吸收的激勵光路徑的過程中遇到的任何熒光。其結(jié)果是，較少的光子到達的焦平面上，從而降低所產(chǎn)生的信號。如果樣品含有熒光基團在整個在如圖5所示的圖像中，如圖所示，這種效應(yīng)變得更加明顯。若丹明染色的聚合物薄膜樣品，在該圖中，本身就是非散射，但包含均勻分布的熒光團濃度高。
在圖5中，在xz掃描的頂部是*靠近物鏡，到試樣（z軸向）為每個xz掃描的深度的函數(shù)繪制成的熒光強度。對于單光子激發(fā)機制（激光共聚焦顯微鏡，圖圖5（a）），強度呈現(xiàn)穩(wěn)步下降，作為激發(fā)光被越來越多地吸收，因為它達到更深的焦平面的穿透深度。鮮明的對比，雙光子吸收只發(fā)生在焦平面上，不吸收的激發(fā)光的光路中的物鏡的焦平面之間的熒光團。因此，所有的激發(fā)能達到的焦平面上，保持恒定的試樣的深度（在本例中的聚合物）的熒光信號。圖5（b）示出的共聚焦和雙光子激發(fā)的顯著區(qū)別，圖中，強度是相對恒定的穿透深度。
第二個機制促進雙光子激發(fā)，在較厚的試樣的性能是“更紅”的激發(fā)光在雙光子激發(fā)顯微鏡患有的試樣比“更藍”中使用的常規(guī)激勵的激勵光的散射少。生物組織可以被認為是具有可變折射率的非均勻介質(zhì)。通過這樣的介質(zhì)中傳播的光被乘以在各個方向散射。在熒光顯微鏡中，激發(fā)光入射在試樣上可以分散到不同程度才達到的焦平面上，因為它返回到檢測器通過試樣產(chǎn)生的熒光也可以進行散射。這些散射效應(yīng)相結(jié)合，以減少收集到的熒光信號。
由于材料的不規(guī)則分布的生物樣本內(nèi)具有可變的屬性，這是不可能的計算模型精確的散射行為。然而，*簡單的近似瑞利散射的餾分，在這種系統(tǒng)中散射的光提供了一個*小的估計。在這種情況下，散射光量的第四功率的光的波長成反比。運用這一關(guān)系的估計，488納米的光（光子）預(yù)計將進行約7倍*過800納米（雙光子）光散射。因此，這兩種不同的散射附加有助于雙光子激發(fā)的激光，可以達到的焦平面的量，進一步增加了試樣的穿透深度。在實踐中，所觀察到的散射與組織結(jié)構(gòu)相互作用總是大于由瑞利近似預(yù)測，但更長的時間（更紅）波長較短（更藍）波長小于總是分散的。熒光顯微技術(shù)在檢測階段中，所發(fā)出的熒光是相同的無論是否利用單或雙光子激發(fā)，因此產(chǎn)生，熒光發(fā)射的散射會影響這兩種方法同樣。
上面列出的第三個因素，是任何激發(fā)或熒光光散射不影響雙光子技術(shù)信號采集顯著，因為它在激光共聚焦顯微鏡。這種差異可以通過考慮在雙光子激發(fā)顯微鏡的圖像形成的物理解釋。聚焦的吸收和散射的差異而缺乏既有助于增加激勵光到達焦平面完整的組織深處，這第三個因素，實際上產(chǎn)生與雙光子激發(fā)的提高圖像的對比度。在圖6中示出的物理方面造成這一。
在共聚焦顯微鏡（參考圖6）中，激發(fā)光（藍色）被聚焦到試樣（一），和從該焦斑的熒光（綠色）被捕獲由物鏡，通過干凈通過針孔，并到達檢測器的（二）。這種熒光是所需要的信號，但它的一些可以被分散，因為它傳遞通過試樣（三）。這種散射的熒光不通過針孔，并因此丟失，未檢測到。這些損失大大降低所檢測到的熒光信號。作為激發(fā)光穿過試樣，它可能被吸收（d）或散才達到的焦點（五）。如果它被吸收，它可以產(chǎn)生熒光。由于該熒光從焦點并不會出現(xiàn)，但不穿過針孔，所以它不被有效地檢測。然而，聚焦熒光的一小部分可以被分散到針孔，然后被檢測。此熒光將創(chuàng)建的背景霧，將大致恒定的圖像，在圖7和圖8中給出的示例中所示。此霧降低了圖像的動態(tài)范圍，從而降低了圖像的對比度。同樣，散射的激發(fā)能產(chǎn)生熒光（五），該熒光也可以向背景灰霧（六）。
（紅色）的激發(fā)光子的雙光子激發(fā)的方法（也參見圖6），可以散（克）在共焦系統(tǒng)中。然而，兩個光子同時被散射的相同的試樣的位置的概率基本上是零，因此，背景灰霧困擾厚的樣品在共焦成像中不產(chǎn)生雙光子激發(fā)。此外，更大的激發(fā)光的比例達到的焦平面（h和i），由于上面所討論的前兩個因素：降低出的離焦吸收和波長較長的雙光子激發(fā)的光的散射減少。重要的是，所產(chǎn)生的熒光（綠色），則即使散射，由光電倍增管（j）條中被檢測到的可能性增加，因為沒有針孔存在來阻止它（十一）。這不敏感的病灶吸收散射效應(yīng)和缺乏允許相當深度內(nèi)標本保存完整的圖像對比度。
在圖7（鯊魚脈絡(luò)叢用熒光素染色）的圖像提供了共聚焦和雙光子顯微成像質(zhì)量的比較。這些圖像被收集在試樣表面，這是允許從這個標本利用激光共聚焦顯微鏡圖像的對比度足夠的*大深度在80微米以下。雖然*亮的功能的信號電平可以很容易地在兩種方法之間匹配的共聚焦圖像（圖7（a））中，整體圖像的對比度大大降低背景灰霧的存在。雙光子激發(fā)的圖像（圖7（b））相比較而言，顯示出優(yōu)異的強度對比。由于散射的熒光厚的生物標本中是顯著的，使用退掃描檢測，即使有一個“開放的”針孔，不足以獲得雙光子激發(fā)的優(yōu)點。
為了實現(xiàn)的全部潛力，一個非退檢測方案（參見圖4），其中的熒光不返回通過掃描系統(tǒng)，因為它必須在共聚焦顯微鏡中，需要增加的熒光收集效率。使用圖7中所示的相同的鯊魚標本，采用退掃描（針孔“開放”）和非退掃描檢測方法在圖8中的圖像的比較。每個檢測的幾何形狀，在相同的成像光學(xué)元件的使用，包括二色鏡，屏障過濾器和光電倍增管檢測器。*初，將試樣用上面提供了一定強度的對比度（圖8（a））的*大深度（140微米）附近的退掃描檢測成像。所有設(shè)置保持固定的，而在圖8（b）中呈現(xiàn)的圖像切換到非退檢測，收集。很顯然，這種非退圖像完全飽和（*大顯示亮度）在許多領(lǐng)域，展示了改進的信號采集與檢測的幾何形狀。的激發(fā)條件，因為在這兩種情況下是相同的，這個信號強度增加八倍可以完全歸咎于收集散射的熒光光子，啟用的非退檢測的幾何形狀。以獲得完整的范圍內(nèi)不飽和的圖像（圖8（c）圖中所示），在光電倍增管的電壓，從1000減少到750伏，這意味著該樣品可以利用的非退檢測裝置，更深層的掃描。事實上，在該樣品上可接受的成像穿透深度的組織，但并不限定于由物鏡的工作距離。
圖像分辨率
與雙光子激發(fā)所獲得的圖像分辨率優(yōu)于實現(xiàn)良好對準的共聚焦顯微鏡。較長的激發(fā)波長（例如，紅色或紅外線，代替紫外線或藍色）的利用率，盡管雙光子激發(fā)的一個有利方面，在一個較大的分辨光斑的實際結(jié)果。如果無法解析的共聚焦顯微鏡中的生物結(jié)構(gòu)，同樣沒有解決在雙光子激發(fā)激光掃描顯微鏡。雖然這一點是很好的理解經(jīng)歷了這些技術(shù)的顯微鏡，在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的潛在用戶通常認為雙光子激發(fā)的優(yōu)勢，包括更高的分辨率。
成像厚標本
如前所述，雙光子激發(fā)的更有效的厚的樣品成像，由于三個因素的綜合效果：聚焦吸收不足使更多的激發(fā)光，以達到預(yù)期的試樣區(qū)域，紅色的是激發(fā)光散熒光散射的影響較少的危害比共聚焦顯微鏡雙光子顯微鏡。當利用長工作距離的光學(xué)元件和非退檢測配置，往往是有限的穿透深度和圖像質(zhì)量的能力，有效地標記組織。引進熒光標簽進入組織變得越來越困難，在更深處。利用綠色熒光蛋白（GFP）在轉(zhuǎn)基因動物中的表達的實驗是在體內(nèi)，有可能提高雙光子激發(fā)成像。轉(zhuǎn)基因動物改進技術(shù)，特定器官和對動物蛋白的檢測采用雙光子激發(fā)熒光標記的發(fā)展提供了巨大的承諾。某些組織特征可能施加額外的限制穿透深度成像厚的標本，要么大量色素組織的特別關(guān)注，如動物肝臟，或高散射組織，如皮膚。
薄的樣品成像
一般情況下，薄的樣品成像并不一定有利于從雙光子激發(fā)比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡的技術(shù)顯著。這樣做的原因是略有增加光在焦平面（在厚的樣品的總的光漂白大大降低相比，現(xiàn)有技術(shù)中，如在圖3中示出），可能會發(fā)生的。有應(yīng)用程序，但是，其中的雙光子激發(fā)是有利的，即使是薄的準備;一個實施例中的紫外線激發(fā)熒光團，如NADH（下面進一步討論）的攝像。在此類實驗中，由紫外線造成的損害更明顯比雙光子誘導(dǎo)漂白。在評估雙光子激發(fā)的潛在好處，它始終是值得首先開展實驗共聚焦顯微鏡。一旦知道期望的成像的共焦所施加的限制，然后很容易地確定是否完成實驗的雙光子激發(fā)的使用將是有利的。
吸收光譜
這是常見的雙光子吸收光譜承擔(dān)相應(yīng)的單光子光譜的相似性很小。到目前為止取得的經(jīng)驗表明，大部分的熒光基團的功能相當好時，雙光子激發(fā)的照明具有兩倍的波長的熒光基團的單光子的吸收峰。對于本文的討論范圍之外的物理-化學(xué)的原因，具有非對稱的化學(xué)結(jié)構(gòu)的熒光基團傾向于堅持這種關(guān)系更加緊密地比對稱的。例如，特征在于，一種非對稱的熒光基團熒光蛋白（CFP，GFP，YFP，和其他），并在兩倍的單光子激發(fā)波長強烈吸收。然而，對于雙光子激發(fā)顯微鏡的能力被充分利用，熒光團的吸收光譜必須進行測量。這是相當多的挑戰(zhàn)技術(shù)上比傳統(tǒng)的單光子吸收光譜測量，只有少數(shù)的該信息的來源存在。作為利用顯微技術(shù)增加，它是可能的雙光子吸收光譜將變得更加普遍可用。
本地化的光化學(xué)
雙光子激發(fā)的一個附加功能是在焦區(qū)的試樣的光化學(xué)反應(yīng)的啟動。各種實驗用的化學(xué)過程，涉及紫外線光致反應(yīng)，可以被取代的雙光子激發(fā)。反應(yīng)的一類，染料的uncaging的，光化學(xué)誘導(dǎo)非熒光分子的熒光，可以啟動單個細胞中，用雙光子激發(fā)的組織。同樣，生物刺激劑或抑制劑可以由相同的激發(fā)過程開鎖。各種各樣的潛在2光子激發(fā)的uncaging的方法有沒有得到充分的發(fā)展，主要是由于產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)，其范圍可以從毫秒到幾秒的動力學(xué)限制。因此，物鏡化合物可能擴散激發(fā)時間，它成為活躍的時間之間的試樣內(nèi)的幾微米。盡管這一困難，該技術(shù)在一些有趣的生物學(xué)的應(yīng)用很可能是有價值的，其中一些是在下面的章節(jié)中討論。
激光光源
用于雙光子激發(fā)顯微鏡的儀器要求幾乎是相同的共聚焦顯微鏡的激光激發(fā)源的異常，這是相當大的差別。*快鎖模激光器系統(tǒng)的兩種類型的一般使用與當前的雙光子激發(fā)顯微鏡：摻鈦藍寶石激光的Nd：YLF激光器。雖然這些系統(tǒng)可以從普通的電源插座供電，不需要冷卻水，他們比小型風(fēng)冷激光共聚焦顯微鏡采用相當昂貴。在Ti：藍寶石激光器（700至1100納米）的波長可調(diào)諧性更大的通用性比單波長的Nd：YLF激光器（1047納米），和目前的商業(yè)模型，鈦藍寶石激光器的波長范圍720至900覆蓋納米通過方便地實現(xiàn)計算機控制。激光照排系統(tǒng)的易用性和多功能性的進一步改善，在可預(yù)見的未來很可能繼續(xù)。
激光功率
所需的激光功率，以激發(fā)熒光基團的含試樣都有一個*佳的限制值。隨著激光功率的增加，熒光強度的增加，熒光團的飽和度點。飽和度的條件下發(fā)生在足以導(dǎo)致顯著的比例存在的熒光分子的激發(fā)，而不是基態(tài)（此功率級大約是單光子激發(fā)，在試樣1毫瓦和50毫瓦的激光功率是在雙光子激發(fā)的試樣）。在高功率水平，額外的光子根本無法激發(fā)更多的熒光分子。任何*出飽和點的激發(fā)能量增加有助于增加的光損傷和光漂白。每個實驗裝置必須束掃描過程中施加的損害進行評估，重要的是要認識到瑣碎的細胞活力測試（如酯酶活性或染料排斥）并不總是準確地反映細胞光損傷。對于許多實驗，更嚴格的功能測試可以提供更多資料。作為例子，在*近發(fā)表的調(diào)查，確認倉鼠胚胎的生存能力通過續(xù)發(fā)展，而在另一種是通過維持正常的葡萄糖刺激的NAD（P）H的響應(yīng)確認胰島的生存能力。
作為雙光子激發(fā)顯微鏡
一些*近發(fā)表的實驗結(jié)果的例子說明常見的情況下，雙光子激發(fā)提供優(yōu)于聚焦成像。雖然在這個討論中沒有提供詳細的實驗，雙光子激發(fā)造成的其光毒性降低的好處亮點聚焦，提高組織成像深度，啟動本地化的光化學(xué)反應(yīng)的能力。
雙光子激發(fā)顯微鏡一般比激光共聚焦顯微鏡，*近的一項研究證明了利用倉鼠胚胎發(fā)育時間推移成像光毒性。在這個例子中，胚胎的發(fā)展要監(jiān)視的連續(xù)10個小時以上，使用雙光子激發(fā)的一個重要的線粒體染料。相比較而言，當聚焦的方法，正常胚胎發(fā)育停止后，只有幾分鐘的共聚焦激光曝光。研究人員得出的結(jié)論是雙光子激發(fā)激光的波長較長的（1047納米）允許胚胎存活率大大增加了時間。同樣的調(diào)查還利用雙光子激發(fā)顯微鏡無機磷酸鹽倉鼠胚胎發(fā)育的影響進行評估。在這個實驗中，生活倉鼠胚胎培養(yǎng)在不同量的無機磷酸鹽，線粒體分布在6個小時的培養(yǎng)，使用雙光子激發(fā)顯微鏡成像。進一步的胚胎發(fā)育，形態(tài)評估后進行27小時和51小時的文化。雙光子照明非擾動的發(fā)展倉鼠胚胎從這些研究提供了明確的證據(jù)，而他們破壞并行共焦成像。
兩個已發(fā)表的研究利用無毒的雙光子激發(fā)的性質(zhì)，來執(zhí)行在人體皮膚的體內(nèi)成像。一項調(diào)查涉及從皮膚采集的自體熒光信號，在不同深度（0?50和100?150微米），利用激發(fā)波長范圍從730到960納米的詳細的光譜。與反射光的共聚焦顯微鏡結(jié)合使用時，在相結(jié)合的手法從皮膚的相同區(qū)域中，提供詳細的非破壞性的反射光，皮膚層的自體熒光圖像。
雙光子激發(fā)提供避免紫外線照射的光毒性作用的能力，在該光譜范圍內(nèi)的被激活的熒光物種。此功能特別有益的成像自然產(chǎn)生降低吡啶核苷酸[ NAD（P）H ]作為細胞呼吸指標。由于NAD（P）H具有小的吸收截面，一個低的量子產(chǎn)率，并吸收在紫外，它是難以激發(fā)和測量，并有可能造成相當大的光損傷。NAD（P）H成像已動用部分分化培養(yǎng)L6肌管細胞的病理生理研究。表現(xiàn)在細胞NAD（P）H圖像的自體熒光圖案主要反映在線粒體中的NADH圈點地區(qū)彌漫的細胞質(zhì)信號。在分化的細胞中，熒光是線粒體本地化為列肌纖維之間的條痕，和伴隨的熒光增加的葡萄糖濃度的增加，可見一斑。本研究證明了在糖代謝中的均勻性，和葡萄糖利用的動力學(xué)可以實時定義為一個單細胞，或可被平均在幾個細胞。
在文獻中已報道的其他領(lǐng)域，調(diào)查為中心對個人的β細胞的胰島內(nèi)NAD（P）H的定量雙光子成像，這是一種準球形微約1000個細胞組成的器官。雙光子技術(shù)的空間分辨率擴大的整體核苷酸成像，允許的細胞質(zhì)和線粒體NAD（P）H的信號的分離。圖9給出一個典型的圖像于一個完整的胰島β細胞的NAD（P）H的自體熒光，顯示從細胞質(zhì)和線粒體中的信號，后者是更明亮，有些點狀。單細胞的輪廓是可見的，如細胞核，這兩者出現(xiàn)暗。在這些區(qū)域的胰島β細胞的細胞質(zhì)和線粒體信號由分離葡萄糖和丙酮酸的代謝詳細檢查成為可能。
目前的模型對葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）建議進一步沿信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的代謝產(chǎn)物刺激了類似的事件，導(dǎo)致胰島素分泌的信號級聯(lián)，雖然的丙酮酸會加強GSIS，但不會誘發(fā)自身的胰島素分泌。利用雙光子激發(fā)成像的NAD（P）H，細胞質(zhì)和線粒體信號分離，所述研究表明，β-細胞代謝丙酮酸，雖然瞬時。這樣一個短暫的線粒體反應(yīng)表明兩個獨立的模型，目前正在研究：要么線粒體丙酮酸運輸或三元周期后期丙酮酸代謝過程中被抑制。利用雙光子激發(fā)技術(shù)，生活胰島被反復(fù)掃描，以產(chǎn)生數(shù)據(jù)采樣的時間間隔是通過生物 化學(xué)的方法無法得到的。此類型的重復(fù)成像根本不能使用共聚焦顯微鏡進行，因為通過光漂白和紫外線光引起的光損傷的限制。
由于雙光子激發(fā)顯微鏡利用鎖模激光器（脈沖），它可以很容易地擴展到組合與熒光壽命成像。基于納秒熒光衰減時間的圖像提供的信息是獨立的熒光濃度。一個潛在的應(yīng)用是利用熒光壽命成像，熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）效率兩個探針之間取得一個明確的值。在*近的一項調(diào)查，雙光子激發(fā)的壽命成像顯微鏡的NAD（P）H的定量測定在不同的亞細胞的NAD（P）H +濃度。NADH水平，在細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)輔阻遏芽期耐冷性，這是在細胞周期調(diào)控的參與者和改造轉(zhuǎn)錄途徑。通過雙光子激發(fā)顯微鏡的NAD（P）H和壽命成像的結(jié)合使用，它表明，在細胞核中的自由的NADH水平密切對應(yīng)的半*大濃度為CTBP綁定。
雙光子激發(fā)的技術(shù)可以結(jié)合范圍廣泛的其他建立的生物物理技術(shù)，包括熒光相關(guān)光譜（FCS）和熒光漂白后恢復(fù)（FRAP）。這些技術(shù)中的每一個通常利用固定單光子（連續(xù)波）激光。FCS技術(shù)確定的職業(yè)數(shù)量和熒光探針固定光束的焦點體積內(nèi)的擴散特性，并已成功地應(yīng)用在分子間的相互作用和擴散研究。通過控制激光焦點區(qū)域，然后通過觀察熒光恢復(fù)熒光漂白，F(xiàn)RAP已經(jīng)來研究宏觀的熒光分子擴散。這兩種FCS和FRAP技術(shù)已被廣泛使用，以調(diào)查對培養(yǎng)的細胞膜熒光探針的擴散特性的。**為止，這些技術(shù)的復(fù)雜性限制了它們的應(yīng)用程序，在體外系統(tǒng)中，細胞培養(yǎng)模型。定量數(shù)據(jù)時，需要從任一方法，在雙光子激發(fā)顯微鏡定義良好的激發(fā)體積是一個優(yōu)勢。此外，F(xiàn)CS和FRAP可以預(yù)期在比單光子激發(fā)的研究雙分子動力學(xué)，在厚的活組織，而采用雙光子是非常有價值的。
深試樣的滲透與雙光子激發(fā)獲得允許在體內(nèi)成像，雖然成像時必須克服一系列的挑戰(zhàn)生活的動物。可通過雙光子激發(fā)體內(nèi)熒光成像通過手術(shù)的開孔在活的動物的皮膚，或通過“窗口”蓋玻片放置到動物。另外一個活的動物工作的并發(fā)癥是熒光標記標本的難度相當大。一個發(fā)表的研究報告，使用的Ca2 +指示劑在活老鼠的神經(jīng)元特異性標記，允許監(jiān)測神經(jīng)功能，采用雙光子激發(fā)技術(shù)。綠色熒光蛋白（GFP）的熒光標記特定器官和蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)基因動物中的表達肯定會導(dǎo)致額外的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)，在體內(nèi)成像。由于活標本的可能性，將在成像過程中移動，體內(nèi)研究的大多數(shù)當前與麻醉動物，成像率增加，以限制這個運動的效果。它很可能是未來的技術(shù)進步，如直接安裝到活體的小型化雙光子顯微鏡，將允許在自由活動動物的體內(nèi)成像。
一些研究人員采用批量裝載鈣指示劑結(jié)合的雙光子激發(fā)顯微鏡映射的神經(jīng)元在小鼠腦片的微型電路。他們的方法是觸發(fā)信號的神經(jīng)元，然后發(fā)起所謂的“跟隨者”的神經(jīng)元連接的鈣信號映射。確定新皮層是由眾多的正是組織的微電路。確定的追隨者屬于幾個區(qū)分解剖類和它們的位置，可以預(yù)測在不同的動物。
一個潛在的非常**的應(yīng)用程序的雙光子激發(fā)顯微三維分辨光致籠化合物，簡稱為的uncaging。例如，定量的雙光子激發(fā)鈣的uncaging了許多技術(shù)的焦點。正如先前所討論的，光化學(xué)的uncaging的反應(yīng)通常是相當慢（范圍從毫秒到秒），它允許物鏡化合物的激發(fā)時，它成為活躍的時間之間的試樣內(nèi)擴散*過幾微米。的擴散不存在某些應(yīng)用中，如“標記”的的細胞uncaging膜無常熒光分子中的一個問題。一組調(diào)查人員已經(jīng)成功地使用雙光子激發(fā)光解釋，結(jié)合激光共聚焦顯微鏡，追蹤海膽胚胎細胞系的發(fā)展。
更快的反應(yīng)的uncaging分子已被成功地利用由其他研究人員在調(diào)查的的興奮劑uncaging，它們采用雙光子激發(fā)的地圖神經(jīng)元受體。在這些研究的過程中，光化學(xué)的uncaging的擴大利用出籠興奮劑控制的位置，在成像介質(zhì)的雙光子激發(fā)的三維性質(zhì)。細胞膜附近開鎖興奮劑，它刺激受體在靠近，通過膜片鉗細胞的過程中被檢測到的。在這種類型的成像，測量興奮性反應(yīng)，而不是發(fā)射光子映射圖像。作為具體的例子，連同用于信號檢測的全細胞鉗的的的uncaging MNI-谷氨酸成功映射谷氨酸受體。標本培養(yǎng)海馬神經(jīng)元和海馬CA1錐體神經(jīng)元的急性片制劑。進行這項研究的研究人員能夠獲得優(yōu)異的側(cè)向和軸向的全寬度半*大值（FWHM）為0.6和1.4毫米的直徑，分別切片中的制劑，指示快速的uncaging反應(yīng)時間。進一步確定，蘑菇棘豐富的α-氨基-3 -羥基-5 -甲基-4 -異唑丙酸（AMPA）型谷氨酸受體，這些受體的分布是高度相關(guān)的脊柱幾何。
結(jié)論
雙光子激發(fā)顯微厚的完整的組織標本，如動態(tài)的活細胞成像提供了巨大的效用。該技術(shù)使得有可能多次實驗中，不能執(zhí)行傳統(tǒng)的成像，或?qū)o法提供所需的信息。依托鎖模（脈沖）激光照射產(chǎn)生足夠的光子密度的焦點，雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦平面。局域激發(fā)的好處是，排放量被限制在狹窄的焦點區(qū)域，提供切片的能力，而不使用一個針孔。此外，激發(fā)區(qū)域有限，因為光損傷主要限于焦量，降低了光毒性。
雙光子激發(fā)顯微鏡雖然不產(chǎn)生更高的分辨率比共聚焦顯微鏡的圖像，但是它允許使用厚的樣品的穿透深度增加。的更大的穿透深度是可能的，部分原因是打開針孔幾何形狀的雙光子顯微鏡，聚焦的激發(fā)光的吸收的情況下，減少散射的激發(fā)光（因為它的波長）。為了充分利用深度滲透，必須使用非退掃描檢測幾何形狀影響散射熒光光子收集效率急劇增加。雙光子激發(fā)的優(yōu)點，被清楚地確定，并允許進行的實驗將是不可能的，利用共聚焦顯微鏡。由于這種技術(shù)的好處從可預(yù)測的技術(shù)改進和成本降低，并且變得更加流行的，它被預(yù)期，將實現(xiàn)越來越多的令人振奮的實驗結(jié)果。